產(chǎn)品目錄

本T4 DNA Ligase是從表達(dá)T4 DNA Ligase 基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后分離純化而來(lái)的，催化相鄰DNA鏈的5’磷酸基團(tuán)和3’羥基基團(tuán)以磷酸二酯鍵結(jié)合反應(yīng)。該酶可催化平末端或粘性末端DNA之間的連接，還可修復(fù)雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切口。本品可應(yīng)用于DNA插入片段和載體DNA的粘性末端和平末端的連接，以及線性DNA的自身環(huán)化。

產(chǎn)品組分：

T4 DNA ligase (5U/μl)————————100 U (20μl)

10×T4 DNA Ligation Buffer——————0.2 ml

50%PEG Solution————————————0.15 ml

活性定義：此酶的活力單位為Weiss Unit。1個(gè)Weiss Unit相當(dāng)于約200個(gè)粘性末端連接單位(cohesive-end ligation unit, CEU)。1個(gè)CEU單位定義為在20μl的連接反應(yīng)體系中，在16℃30分鐘內(nèi)，能使50%的經(jīng)HindIII消化的λDNA片段連接所需的酶量。

注意事項(xiàng)：

1、T4 DNA Ligase的終用量不要過(guò)推薦的用量，否則影響連接效率。

2、PEG可以極大提高平末端的連接效率，我們推薦加入終濃度為5% PEG Solution以提高平末端的連接效率。

3、為了提高轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化時(shí)建議所加入連接產(chǎn)物的量不要過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。

4、由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比較粘稠容易掛壁，建議使用前短暫離心將液體收集到管底，取樣時(shí)槍頭盡量不要深入液面太深以免粘在槍頭上造成損失。
儲(chǔ)存條件：-20℃。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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