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pGL6-miR的主要工作原理是，把目的基因的3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region, 3’-UTR)或其它適當(dāng)序列插入到螢光素酶基因(luc2)的下游，轉(zhuǎn)染細胞并檢測螢光素酶的表達。如果細胞內(nèi)源或外源表達的miRNA與靶序列結(jié)合，通常會抑制螢光素酶的翻譯或促進mRNA的降解，從而使螢光素酶的表達量減少。因此通過本報告基因質(zhì)粒檢測螢光素酶的表達水平，可以檢測內(nèi)源或外源表達的miRNA是否對插入的靶序列有調(diào)控作用。并且可以通過靶序列中預(yù)測的miRNA結(jié)合位點的突變，用于比較突變前后螢光素酶表達水平的變化。如果預(yù)測的miRNA位點突變后，miRNA的調(diào)控作用消失，則基本上說明突變的位點就是miRNA在靶序列中具體的結(jié)合位點。

pGL6-miR報告基因質(zhì)粒是一種用于microRNA(miRNA)等研究的螢光素酶報告基因質(zhì)粒。該質(zhì)?？捎糜诎涯康幕虻?/span>3’非翻譯區(qū)(3’-untranslated region, 3’-UTR)或其它適當(dāng)序列插入到其多克隆位點，然后在哺乳動物細胞中高靈敏度地檢測特定microRNA(miRNA)或其它非編碼RNA等對該基因3’-UTR或其它靶序列調(diào)控活性的報告基因質(zhì)粒。

pGL6-miR以pGL6質(zhì)粒為模板，具有氨芐青抗性，并在螢火蟲螢光素酶基因之后添加了多克隆位點，便于插入目的基因的3’-UTR或其它適當(dāng)?shù)陌行蛄小?/span>

pGL6-miR帶有中低等度的PGK啟動子，有利于檢測miRNA等對于螢火蟲螢光素酶表達水平的下調(diào)作用，即當(dāng)miRNA的抑制作用較弱時也能檢測到。并且PGK啟動子可以在人、大鼠、小鼠甚至酵母細胞中都可以發(fā)揮作用。

使用說明：

1. 使用時請先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)?？梢酝ㄟ^酶切電泳進行鑒定，或通過測序進行鑒定。

2. 插入靶序列：在pGL6-miR多克隆位點選取適當(dāng)?shù)拿盖形稽c，經(jīng)酶切處理后連入目的基因的3’-UTR或其它適當(dāng)?shù)陌行蛄小?/span>

3. 以此質(zhì)粒為模板構(gòu)建的質(zhì)?？梢杂贸Ｒ?guī)的細胞轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染細胞。檢測時可以采用螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒(YT271)或雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（YT273）。
儲存條件：-20℃。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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