產(chǎn)品目錄

本產(chǎn)品是環(huán)狀的可以制備Clion藍白T載體的質(zhì)粒DNA。T載體是克隆PCR擴增產(chǎn)物的必不可少的工具，但是由于市場上的各種T載體質(zhì)量參差不齊，用戶很難購買到滿意的產(chǎn)品；同時購買的T載體為線性DNA，不能保種，必須反復購買，累計成本很高。為解決這一問題，我司特推出可保種型T載體，用戶只需要購買Xcm I內(nèi)切酶就可以自己制備高質(zhì)量的T載體，隨用隨配，十分方便。

產(chǎn)品特點：

1.一次購買，終身擁有。本產(chǎn)品提供制備T載體用的環(huán)形質(zhì)粒DNA，可以象其他質(zhì)粒一樣保種并長期保存。

2. 隨用隨配，十分方便。用戶只需要提供Xcm I 限制性內(nèi)切酶和基本分子生物學實驗條件，就可以自己制備T載體。整個過程只需要兩天。

3. T載體含T 率為100%。本方法不是使用傳統(tǒng)的加尾法，而是使用Xcm I酶切法。質(zhì)粒的多克隆位點上預先插入了一段長為1.3 Kb的Xcm I DNA片段,經(jīng)Xcm I酶切后回收得到的質(zhì)粒DNA(T載體)兩端自然全部帶有T 突出，比例遠遠高于用Taq DNA聚合酶加尾法和TdT 加尾法得到的T載體。

4. 方便各種下游操作。用本產(chǎn)品得到的藍白T載體插入位點兩側(cè)有多種常見的酶切位點，便于后續(xù)克??； Xcm I 位點在Alpha 互補區(qū)，可以使用藍白斑篩選重組子；兩邊還有T7和SP6 RNA聚合酶啟動子，便于制備RNA探針。儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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