產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
大腸桿菌BL21 Star(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	E.coli BL21 Star(DE3) Chemical Competent Cell	10*100μL	CS-01F97561

介紹

BL21 Star(DE3)感受態(tài)細(xì)胞來源于BL21(DE3)菌株，由特殊工藝制作，使用pUC19質(zhì)粒檢測本產(chǎn)品，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10cfu/μg。

BL21 Star(DE3)菌株的特點(diǎn)是含有rne131基因突變體。rne131突變基因能夠增菌株細(xì)胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性，從而有效提高蛋白表達(dá)能力。本產(chǎn)品主要適用于T7啟動子表達(dá)載體(如pET 系列)的高水平蛋白表達(dá)。

菌株基因型為：F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm rne131(DE3)。

儲存條件：干冰運(yùn)輸、-80℃保存，有效期半年。

自備試劑：目的DNA、LB培養(yǎng)基等。

使用方法：

1.從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100μL，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。以下實(shí)驗(yàn)以100μL感受態(tài)細(xì)胞為例。

2. 取 100μL冰上融化的BL21 Star(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

3. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

4. 向離心管中加入700μL不含抗生素的無菌培養(yǎng)基(LB)，混勻后37℃，200rpm 復(fù)蘇60分鐘。

5. 取100μL左右菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上。如果轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒，可以減少涂布的量。
6. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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