產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
大腸桿菌DH10Bac化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	E.coli DH10Bac Chemical Competent Cell	0.1mL*10	CS-01F97556

介紹

本產(chǎn)品是采用特殊工藝處理得到的大腸桿菌DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞，適用于昆蟲桿狀病毒Bac-to-Bac 系統(tǒng)中同源重組的菌株，用于產(chǎn)生重組Bacmid。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，本產(chǎn)品轉(zhuǎn)化效率可達(dá)107CFU/μg。

DH10Bac細(xì)胞包含親本Bacmid bMON14272和輔助質(zhì)粒 pMON7124。親本Bacmid 包含一個(gè)mini-F 復(fù)制子、卡那抗性基因、att Tn7 位點(diǎn)和lac Zα-互補(bǔ)因子。

輔助質(zhì)粒包含tns ABCD 區(qū)域，該區(qū)域提供了mini-Tn7從供體質(zhì)粒插入親本Bacmid 靶位點(diǎn)所需要的轉(zhuǎn)座蛋白。供體如pFastBac 系列質(zhì)粒(pFastBac1，pFastBacDual等)含有Tn7R和Tn7L 同源重組臂，Tn7R和Tn7L 之間包含慶大抗性基因、昆蟲病毒多角體基因啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和SV40 病毒的PolyA 加尾信號(hào)。當(dāng)含有靶基因pFastBac的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH10Bac細(xì)胞后，發(fā)生重組后就可產(chǎn)生重組Bacmid，提取純化重組Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9或Sf21 就可以包裝產(chǎn)生昆蟲病毒。此外，DH10Bac細(xì)胞中的The φ80dlacZDM15基因的產(chǎn)物可以實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的α-互補(bǔ)現(xiàn)象，用于重組bacmid的藍(lán)白斑篩選。

?菌株基因型為：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1endA1 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK λ-rpsL nupG/pMON14272/pMON7124。

儲(chǔ)存條件：干冰運(yùn)輸、-80℃保存，避免反復(fù)凍融，有效期半年。

自備試劑：重組質(zhì)粒、SOC或LB培養(yǎng)基等。

使用方法：

1. 制備含有如下抗生素的LB 固體平板：50 μ g/mL Kanamycin，7 μ g/mL gentamicin，10μg/mL tetracycline，100μg/mL X-gal，40μg/mL IPTG。

2. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100μl，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。

以下實(shí)驗(yàn)以100μL感受態(tài)細(xì)胞為例。

3. 待感受態(tài)細(xì)胞融化后，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入1-10 ng 重組質(zhì)粒，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30分鐘。

4. 42℃熱擊90秒，迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3分鐘。

5. 每個(gè)離心管中加入900μl 無菌的SOC(不含抗生素)，混勻后置于37℃ 搖床，200rpm 振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。

6. 用 SOC培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋，如分成3個(gè)稀釋梯度10-1,10-2,10-3。

7. 取 100μl的各個(gè)梯度的培養(yǎng)物用于涂布。等平板中的液體完全吸收后，倒置平板，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)。

8. 保留剩余的菌液保存于4℃，視平板上菌落生長(zhǎng)情況決定去留。

注意事項(xiàng)：

1. 涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。

2. 新制備的固體培養(yǎng)基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養(yǎng)。
3. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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