產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
通用型質(zhì)粒小量抽提試劑盒(3mL)	Universal Plasmid Mini Preparation Kit(3mL)	50次\|200次	CS-01F96664

本試劑盒是一種用于從大腸桿菌中進行小量質(zhì)粒快速抽提的通用型離心柱式試劑盒。

本試劑盒不僅適用于常用的EndA-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等，也適用于EndA+菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，能有效避免EndA+菌株中高豐度核酸酶的污染，并適用于從糖類修飾水平高的野生菌株中提取質(zhì)粒。

保存條件：室溫保存，一年有效。

注意事項：

次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加到溶液I (懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標記。加入RNase A后4℃存放。

次使用前請根據(jù)說明書和瓶上的標示，在溶液IV (洗滌液)中加入相應(yīng)體積的無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標記。

注：

① 50次規(guī)格的溶液IV (洗滌液)次使用前每瓶加入27mL無水乙醇；

② 200次規(guī)格的溶液IV (洗滌液)次使用前每瓶加入54mL無水乙醇。

溫度較低時，溶液II和溶液III可能會有沉淀產(chǎn)生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。溶液II請勿過分劇烈混勻，否則會產(chǎn)生大量氣泡。

溶液II使用完后，一定要蓋緊瓶蓋，防止被空氣中二氧化碳酸化。

溶液II有堿性，溶液II、溶液III、溶液PB和溶液IV對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。

廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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