產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(1.5～5mL)	SgPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit(1.5-5mL)	50次\|100次	CS-01F96639

本試劑盒采用了一種新型的吸附材料，新吸附柱擁有良好的流速、的DNA結(jié)合能力和優(yōu)秀的洗脫效率。改良的配方使試劑盒的菌液裂解能力、DNA與吸附柱的結(jié)合能力大大加，新型裂解染料Visualysis的加入讓裂解過(guò)程變得可視、可控，實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒得率大化。對(duì)于高拷貝質(zhì)粒，從6mL過(guò)夜菌液（OD600=2.0）中可以獲得過(guò)35μg的質(zhì)粒DNA。操作過(guò)程快速、方便，無(wú)需使用酚/氯仿抽提，無(wú)需乙醇沉淀，整個(gè)抽提過(guò)程可以在20分鐘內(nèi)完成。由本試劑盒抽提得到的質(zhì)粒純度高，OD260/OD280比值一般在1.8～1.9之間，OD260/OD230比值大于2.0，可直接用于轉(zhuǎn)化、DNA測(cè)序、PCR、基于PCR的突變、體外轉(zhuǎn)錄、酶切等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

試劑盒特點(diǎn)：

使用新型吸附柱材料，吸附容量大，洗脫效率高。

新型裂解染料Visualysis讓裂解過(guò)程可視化，實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒得率大化。

操作過(guò)程快速、方便，無(wú)需使用酚/氯仿抽提，無(wú)需乙醇沉淀，全過(guò)程可在30分鐘內(nèi)完成。

保存：常溫（18～25℃），RNase A收到后，請(qǐng)及時(shí)置于2～8℃保存，長(zhǎng)期貯存請(qǐng)于-20℃放置。

注意：

加入RNase A后，Buffer P1請(qǐng)存放于2～8℃，有效期為半年。其他組分可于室溫存放—年，長(zhǎng)期存放請(qǐng)置于2～8℃。

Buffer P3和去蛋白液DW1中含有刺激性的化合物，操作過(guò)程中應(yīng)穿上實(shí)驗(yàn)服，戴好乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮膚或眼睛后，請(qǐng)立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)生的幫助。

快速操作流程：

準(zhǔn)備工作。

□ 檢查Buffer P1中是否已經(jīng)加入RNase A。

□ 檢查洗滌液WB中是否已經(jīng)加入無(wú)水乙醇。

□ 檢查Buffer P2和P3是否出現(xiàn)沉淀。

取1.5～5mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，8000g離心2分鐘收集菌體，棄盡培養(yǎng)基。

在沉淀中加入250μL Buffer P1，徹底懸浮菌體。

加入250μL Buffer P2，立即溫和顛倒離心管5～10次混勻。室溫靜置2～4分鐘。

加入350μL Buffer P3，立即溫和顛倒離心管5～10次混勻。

12000g離心5～10分鐘。將上清液移入吸附柱，8000g離心30秒，倒掉收集管中液體。

(選做）加入500μL去蛋白液DW1，9000g離心30秒，倒掉收集管中液體。

加入500μL洗滌液WB，9000g離心30秒，倒掉收集管中液體。

重復(fù)步驟8一次

空吸附柱9000g離心1分鐘。

將吸附柱放入—個(gè)干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50～100μL洗脫液EB，室溫靜置1分鐘后，離心1分鐘。保存管中DNA溶液。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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