產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒(1～5mL)	HighPure Mini Plasmid DNA Kit(1-5mL)	50次	CS-01F96595

本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，再通過(guò)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料為本公司新型材料，高效、專一吸附DNA。由于增加了過(guò)濾柱，與普通的提取方法相比，本試劑盒可去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物，適用于提取1～5mL過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌，質(zhì)粒提取得率和質(zhì)量與宿主菌的種類和培養(yǎng)條件，細(xì)胞的裂解，質(zhì)?？截悢?shù)，質(zhì)粒的穩(wěn)定性，抗生素等因素有關(guān)。

使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞及各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接等實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存條件：

該試劑盒置于室溫(15～25℃)干燥條件下，可保存12個(gè)月，更長(zhǎng)時(shí)間的保存可置于2～8℃。2～8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，使用前應(yīng)將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫放置一段時(shí)間，必要時(shí)可在37℃水浴中預(yù)熱10min，以溶解沉淀。次使用前將RNase A加入溶液P1中，混勻后置于2～8℃保存，可穩(wěn)定保存12個(gè)月以上。單獨(dú)包裝的RNase A在室溫可穩(wěn)定保存12個(gè)月以上。

注意事項(xiàng)：（請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng)）

溶液P1在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置于2～8℃保存。

使用前先檢查平衡液BL、溶液P2和P3是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

注意不要直接接觸溶液P2和P3，使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子。

所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心，速度為12000rpm (~13400×g)。

提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)前使用平衡液處理吸附柱，可以充分激活硅基質(zhì)膜，提高得率。

用平衡液處理過(guò)的柱子好當(dāng)天使用，放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響效果。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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