產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
酵母質(zhì)粒小提試劑盒(1～5mL)	Yeast Plasmid DNA Mini Kit (1-5mL)	50次	CS-01F96593

本試劑盒對(duì)普通的堿裂解法進(jìn)行了改進(jìn)，可快速得到高純質(zhì)粒DNA，并祛除基因組DNA。通過離心吸附柱吸附、洗滌DNA，方便快速，不需使用有毒有害試劑，可同時(shí)處理多個(gè)樣品。除適用于酵母細(xì)胞外，也可用于大腸桿菌。質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)粒拷貝數(shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。

保存條件：

室溫（15～25℃)干燥條件下，可保存12個(gè)月，更長(zhǎng)時(shí)間的保存可置于2～8℃。2～8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，使用前應(yīng)將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫放置一段時(shí)間，必要時(shí)可在37℃水浴中預(yù)熱10min，以溶解沉淀。溶液YP1加入RNase A后，應(yīng)置于2～8℃，可穩(wěn)定保存6個(gè)月。單獨(dú)包裝的RNase A可在室溫保存12個(gè)月。

需要自備的試劑：

Lyticase

buffer：用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)配制1.2M

0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)的配制：

77.4mL 0.1mol/L Na2HPO4+22.6mL 0.1mol/L NaH2PO4

注意事項(xiàng)：（請(qǐng)務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項(xiàng))

溶液YP1使用前先加入RNaseA （將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置于2～8℃保存。

使用前先檢查平衡液BL、溶液YP2和YP3是否出現(xiàn)渾濁，如有混濁現(xiàn)象，可置于37℃水浴中加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

溶液YP2和YP3使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子。

所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心，速度為12000rpm （~13400×g)。

提取的質(zhì)粒量與酵母菌的培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)前使用平衡液處理吸附柱，可以大限度激活硅基質(zhì)膜，提高得率。

用平衡液處理過的柱子好當(dāng)天使用，放置時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)影響效果。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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