產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
高純酵母質(zhì)粒大量提取試劑盒(100～180mL)	Yeast Plasmid Maxi Kit(100-180mL)	10次	CS-01F96585

本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞并結(jié)合破壁酶特異消化酵母細(xì)胞壁，能在1小時內(nèi)從酵母培養(yǎng)液中分離出高純度質(zhì)粒DNA。酵母收集后，加入破壁酶去除細(xì)胞壁后，然后堿裂法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低PH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

試劑盒特點(diǎn)：

離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

快速、方便，不需要使用有毒的、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測序等各種分子生物學(xué)實驗。

保存：室溫儲存12個月不影響使用效果。

保存事項：

次使用時，將試劑盒所帶的全部RNaseA加入溶液YP1（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的質(zhì)粒可能會有微量RNA殘留，在溶液YP1中補(bǔ)加RNase A即可。

環(huán)境溫度低時溶液YP2中SDS可能會析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）

提示：

① 次使用前請先在漂洗液WB瓶中加入量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

② 將RNase A全部加入溶液P1中，混勻。每次使用后置于2～8℃保存。

③ 將溶液P3放在冰上預(yù)冷。

④ 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巰基乙醇，回復(fù)到室溫備用。

取約100～180毫升酵母培養(yǎng)物，6000×g，離心10分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。

收集過50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個50mL管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟1，直到收集到足夠的菌體。

加入10mL Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞；加入0.1g破壁酶（破壁酶臨用前用2mL Sorbitol buffer溶解），充分顛倒混勻，37℃溫育1～2小時消化細(xì)胞壁，中間可顛倒數(shù)次幫助消化。

如果破壁效果不好導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)量過低，可以加大破壁酶用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間或者提高溫度到45℃來提高效果，不適合破壁消化的酵母可選用Lyticase或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠渦旋振蕩，反復(fù)凍融等。

6000×g，離心10分鐘，盡可能吸棄上清，加入7mL溶液YP1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。

如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

加7mL的溶液YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)4～7次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。

溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應(yīng)過5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準(zhǔn)確的5分鐘。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。

加10mL溶液YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)4～7次，充分混勻此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。冰上靜置5～10分鐘，4℃，至少2500×g離心20分鐘(加大離心力可相應(yīng)縮短離心時間，如15000×g離心10分鐘)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。

加入溶液YP3后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀，如果上清中還有飄浮白色沉淀，可再次離心后取上清。

可選，一般不需要：4℃，2500×g再次離心10分鐘，小心取上清。

將上一步所得上清加入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），靜置2分鐘，2500×g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。

如果上清體積過20mL，可以分多次過柱。

加入10mL去蛋白液PD，2500×g離心2分鐘，棄掉廢液。

加入10mL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），2500×g離心2分鐘，棄掉廢液。

重復(fù)操作步驟9一次。

將吸附柱DC放回空收集管中，高速（好大于9000×g，如果離心機(jī)轉(zhuǎn)速低，需要相應(yīng)延長離心時間）離心10分鐘以干燥膜基質(zhì)殘留乙醇，用槍頭吸除內(nèi)圈壓環(huán)和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。

該步驟目的為徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制下游反應(yīng)并且嚴(yán)重降低洗脫效率，降低質(zhì)粒產(chǎn)量。如果洗脫產(chǎn)量低，則必須加做步驟12。

可選步驟:選擇以下兩種方法之一干燥柱子：

① 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分鐘；

② 將柱子放置于60～65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10～15分鐘。

取出吸附柱DC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加1mL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65～70℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置2分鐘，6000×g離心5分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心2分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是小體積不應(yīng)少于0.6mL，體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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