產(chǎn)品目錄

本試劑盒使用特殊的結(jié)合緩沖液能夠高效純化>15nt的單鏈或者雙鏈DNA和RNA。特別適用于從標(biāo)記反應(yīng)（標(biāo)記，同位素標(biāo)記，標(biāo)記等）混合物中回收小片段標(biāo)記探針，去除未反應(yīng)的核苷酸、短oligos、染料、酶、鹽離子等。典型的回收率高達(dá)80～90%，每個(gè)離心吸附柱每次可吸附的DNA量為10μg。使用本試劑盒回收的RNA或者DNA可適用于in Situ Hybridization、Northern blot、RNAi、Gel shift assay、Ligation、Sequencing、Microarray analysis等實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。

使用了優(yōu)質(zhì)結(jié)合液，不含傳統(tǒng)結(jié)合液的碘化鈉和高氯酸鹽，不抑制回收后酶切、連接克隆等下游反應(yīng)。

獨(dú)特的配方保證了該試劑盒比一般試劑盒回收效率大大提高。并且適用于回收單鏈或者雙鏈DNA和RNA。

快速、方便，不需要使用有毒的、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。

保存事項(xiàng)：

室溫保存，有效期12個(gè)月。避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

平衡液：

介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長(zhǎng)期放置過(guò)程中會(huì)同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預(yù)處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是堿性溶液，若不小心碰到，請(qǐng)用大量自來(lái)水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過(guò)程中可能有沉淀生成，請(qǐng)加熱至37℃使沉淀完全消失。

什么情況下使用：一般剛買(mǎi)來(lái)2,3個(gè)月的新硅膠柱子不需要使用平衡液。時(shí)間存放較長(zhǎng)吸附效率降低的硅膠柱子，可使用平衡液進(jìn)行預(yù)處理來(lái)提高硅膠柱子結(jié)合能力從而提高核酸產(chǎn)量?；蛘哳A(yù)期片段難回收，或者回收起始量低預(yù)期產(chǎn)量低的情況，也可使用平衡液來(lái)提高回收效率。

使用方法：取一個(gè)新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μL的平衡緩沖液至柱子中。13000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時(shí)平衡液預(yù)處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

操作步驟：

提示：次使用前請(qǐng)先在漂洗液RW中加入量無(wú)水乙醇，加入后請(qǐng)及時(shí)打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

估計(jì)樣品體積（低體積50μL，不夠可用滅菌水補(bǔ)足；回收RNA需要用RNase free H2O補(bǔ)足），向其中加入10倍體積的結(jié)合液OB，溫和地充分混勻（PCR反應(yīng)體系無(wú)需去除石蠟油或礦物油）。

回收>100bp片段時(shí)候，只需要加5倍體積結(jié)合液OB。

將上一步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置1分鐘，12000rpm離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液。

吸附柱大容積為720μL，若溶液體積大于720μL，可分批加入。

加入500μL漂洗液RW（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12000rpm離心30秒，棄掉廢液。

加入500μL漂洗液RW，12000rpm離心30秒，棄掉廢液。

將吸附柱EC放回空收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

取出吸附柱EC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加30～50μL RNasefree H2O，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。如果需要較高濃度核酸，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要核酸濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是小體積不應(yīng)少于25μL，體積過(guò)小降低核酸洗脫效率，減少產(chǎn)量。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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