產(chǎn)品目錄

本試劑盒采用新型硅基質(zhì)膜離心柱及特殊的緩沖液系統(tǒng)，可從聚丙烯酰胺凝膠中簡(jiǎn)捷高效回收20bp～500bp的短片段DNA片段，回收效率可高達(dá)85%。并可大限度去除雜質(zhì)，獲得高純度的DNA，所得到的DNA可直接用于酶切、連接、測(cè)序等后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

適用范圍廣泛，可以回收20bp～2kb的單鏈或者雙鏈DNA。

使用了優(yōu)質(zhì)結(jié)合液，不含傳統(tǒng)結(jié)合液的碘化鈉和高氯酸鹽，不抑制回收后酶切、連接克隆等下游反應(yīng)。

獨(dú)特的配方保證了該試劑盒比一般試劑盒回收效率大大提高。

快速、方便離心柱型，不需要使用有毒的、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。

保存：RT，有效期12個(gè)月

注意事項(xiàng)：

避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)。

結(jié)合液中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水或者生理鹽水沖洗。

電泳時(shí)好使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。

切膠時(shí)，紫外照射時(shí)間應(yīng)盡量短，以免對(duì)DNA造成損傷。也可以選擇可見光染料染色后在可見光下切膠會(huì)避免紫外對(duì)DNA損傷。

回收率與片段大小、凝膠濃度、初始DNA量和洗脫體積有關(guān)。

操作步驟：

提示：次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入量無水乙醇，加入后請(qǐng)及時(shí)打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

切取含DNA片段的PAGE凝膠（100mg左右，盡可能多地把多余的膠切除，否則會(huì)影響回收效率），放入1.5mL離心管中，用移液槍頭盡可能搗碎（好先在酒精燈上將槍頭的口燒密閉再用于搗碎），搗得越細(xì)越好。

向凝膠中加入1-2倍體積的Diffusion Buffer （如100mg凝膠加入100-200μL Diffusion Buffer），55℃溫浴30分鐘-2小時(shí)，期間每15分鐘渦旋震蕩混勻，促進(jìn)膠中DNA擴(kuò)散到溶液中。

一般來說，回收片段越大，DNA擴(kuò)散需要的時(shí)間越長，100bp左右的DNA片段溫浴30分鐘就可以（時(shí)間長些也不影響回收效果）；

如果回收500bp-1000bp的DNA片段，可以將溫浴時(shí)間延長3-5個(gè)小時(shí)。也可以37℃溫浴12-16小時(shí)過夜。

12,000rpm離心5分鐘。小心取上清轉(zhuǎn)入新的離心管。記錄上清體積。

加入9倍上清體積的Binding Buffer，混勻?；厥掌?/span>>100bp時(shí)，加5倍上清體積的Binding Buffer即可。

將上一步所得溶液加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），室溫放置1分鐘，12,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。吸附柱大容積為750μL，若溶液體積大于750μL，可分批加入。

加入600μL漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。

重復(fù)步驟6一遍。

將吸附柱EC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

取出吸附柱EC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加30-50μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。如果需要較高濃度核酸，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要核酸濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是小體積不應(yīng)少于25μL，體積過小降低核酸洗脫效率，減少產(chǎn)量。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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