產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
高純度質(zhì)粒提取試劑盒(1～5mL)	High purity Plasmid Extraction Kit(1-5mL)	100次\|200次	CS-01F96580

本試劑盒采用經(jīng)典的堿裂解法裂解細(xì)菌，再通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合DNA的特性，可以從1～5mL大腸桿菌LB培養(yǎng)液中快速提取3～20μg純凈的高拷貝質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)?？蛇m用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等實驗。然而，對質(zhì)粒純度要求更高的轉(zhuǎn)染實驗（要求無內(nèi)毒素），此試劑盒不能達(dá)到要求。

盡管該試劑盒可以抽提較大的質(zhì)粒（＞10kb），但我們不推薦使用。如果一定要使用，請參考以下方法：加大菌體使用量（使用5～10mL過夜培養(yǎng)物），同時按照比例增加P1、P2、P3的用量；洗脫緩沖液應(yīng)在70℃預(yù)熱，在吸附和洗脫時可以適當(dāng)?shù)难娱L時間，以增加提取效率，其它步驟相同。

本試劑盒使用了Lysis Dye，菌體裂解是否完全一目了然。由于判斷菌體裂解和中和是否徹底更主要取決于操作者的經(jīng)驗，所以我們增加了Lysis Dye（一種能使裂解/中和體系變換顏色的試劑）來幫助觀察裂解/中和的程度。加入P1后，Lysis Dye使菌液變?yōu)闇啙岬募t色；加入P2后，Lysis Dye立即使溶液變?yōu)槌吻宓募t色，裂解是否完全只要觀察紅色溶液是否澄清，如果紅色非常均一，表明裂解充分；在完全裂解的體系中加入P3混勻后，體系立即變?yōu)辄S色，任何紅色的殘留表明沒有完全混勻或者中和不徹底。

本試劑盒增加了去蛋白液PD，能更加徹底地去除蛋白污染，得到純度更高的質(zhì)粒。

保存：室溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年；更長時間的保存可置于2～8℃。2～8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。單獨(dú)包裝的RNase A在-20℃可穩(wěn)定保存1年以上。加入RNase A后的溶液P1應(yīng)置于2～8℃保存，可穩(wěn)定保存半年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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