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本試劑盒采用離心吸附柱結(jié)合獨特的緩沖液系統(tǒng)，從酶切、PCR等反應(yīng)溶液中純化DNA片段，同時除去蛋白質(zhì)、無機鹽離子及寡核苷酸引物等雜質(zhì)。使用本試劑盒可回收100bp～10kb的DNA片段，回收率大于80%（<100bp和>10kb的DNA片段回收率為30～50%）。每個吸附柱每次多可吸附的DNA量約為10μg。使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、測序、文庫篩選、連接和轉(zhuǎn)化等實驗。

保存條件：

本試劑盒在室溫（15～25℃）干燥條件下，可保存12個月；更長時間的保存可置于2～8℃。

注意：當(dāng)?shù)蜏刭A存時，使用前應(yīng)先將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫中放置一段時間，必要時可在37℃水浴中預(yù)熱10～20分鐘，以平衡溶液溫度。

操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

在PCR反應(yīng)液中直接加入5倍體積的PB液，顛倒混勻后，全部加入到吸附柱CA2中，10000g離心30～60秒，到掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2重新放入收集管中。

注：

如果PCR反應(yīng)體系使用了石蠟油，無需去除，但要使用10倍體積的PB液。

如果反應(yīng)體系小于50μL，用水補至50μL體系，再加入PB液。

如果體系體積大于700μL，請分次上柱，保證全部溶液均加入到吸附柱中。

向吸附柱CA2中加入700μL漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），10000g離心30～60秒，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。

向吸附柱CA2中加入500μL漂洗液PW，10000g離心30～60秒，倒掉廢液。

將離心吸附柱CA2放回收集管中，10000g離心2分鐘，盡量除去漂洗液。

注意：此步必不可少！如果漂洗液有殘留，將會影響回收效率和DNA質(zhì)量，進而影響下游實驗；離心后將吸附柱蓋子打開，室溫放置2分鐘，這樣將有助于徹底揮發(fā)殘余乙醇。

將吸附柱放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。10000g離心2分鐘收集DNA溶液。

注意：

可將洗脫緩沖液EB預(yù)熱到60～70℃后再加到吸附膜上，這樣可以提高洗脫效率。

CA2柱的洗脫體積不應(yīng)少于20μL，體積過小將會降低回收效率。

洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0～8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

DNA產(chǎn)物-20℃保存。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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