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RNase A(來源于牛胰腺)

  • 產品貨號:CS-01F96572
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  • 產品產地:國產
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  • 含量:100mg|1g
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容:RNase A(來源于牛胰腺)現貨供應,價格實惠。

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RNase A(來源于牛胰腺)

Ribonuclease A from bovine pancreas

100mg|1g

CS-01F96572

RNase A一種含4個二硫鍵的單鏈多肽,分子量約為13.7kDa(氨基酸序列)。作為一種核糖核酸內切酶(endoribonuclease),特異性降解單鏈RNA上的胞(C)或(U)殘基。具體來說,切割識別的是由某核苷酸上的5-核糖和相鄰的類核苷酸3-核糖上磷酸基團形成的磷酸二酯鍵,從而使得2,3-環(huán)磷酸水解為對應的3-核苷磷酸(比如,pG-pG-pC-pA-pGRNase A切割產生pG-pG-pCpA-PG)。

RNase A切割單鏈RNA活性高,推薦工作濃度為1-100μg/mL,兼容于各種反應體系。低鹽濃度(0-100mM NaCl),可用來切割單鏈RNA,雙鏈RNA,以及RNA-DNA雜交形成的RNA鏈。然而,高鹽濃度(≥0.3M),RNase A僅特異性切割單鏈RNA

RNase A常見的應用在于質粒DNA或基因組DNA制備過程中去除RNA,此制備過程中DNase酶活性的存在與否是需要重視的污染之一,可采用水浴煮沸這種傳統(tǒng)方法來滅活DNase活性。另外,本品還可用于RNA酶保護分析、RNA序列分析等分子生物學實驗。

貯存液制備:

此為RNase A儲存液配制的常用方法之一,也可以根據實驗室傳統(tǒng)的方法,或者參考文獻資料使用其他方法制備儲存液(如直接溶于10mM Tris-Cl,pH7.5或者Tris-NaCl溶液)。

1.利用10mM的醋酸鈉(pH5.2)制備10mg/mLRNase A貯存液;

2100℃加熱15min;

3.冷卻到室溫,加入1/10體積的1M Tris-HClpH7.4),調其pH7.4(如:5mL 10mg/mLRNase儲存液加入500μL 1M Tris-HCl,pH7.4);

4.分裝于-20℃凍存,可穩(wěn)定保存長達2年。

 

注意:在中性條件下煮沸RNase A溶液,會有RNase沉淀形成;在更低的pH下將其煮沸,如有沉淀可以觀察到,可能由于蛋白雜質存在造成。煮沸之后若發(fā)現沉淀,可通過高速離心(13,000rpm)去除雜質,然后分裝凍存。

實驗步驟:
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養(yǎng)板面積而定,不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c.細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。
3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節(jié)部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者:上海莼試生物技術有限公司

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