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本試劑盒采用溫和的溶膠液，可以使瓊脂糖凝膠完全融化，同時(shí)避免在高溫下DNA發(fā)生脫嘌呤和末端水解，保持DNA完整的生物學(xué)活性。采用硅膠膜選擇性吸附DNA的方法回收DNA，適合從TAE或者TBE瓊脂糖凝膠中純化回收多至4μg，長(zhǎng)度介于50bp-10kb的DNA片段，回收率為90%.。純化回收的DNA可直接酶切、連接、轉(zhuǎn)化細(xì)菌、測(cè)序、PCR、雜交等后續(xù)操作。

注意事項(xiàng)：

1、Wash Buffer在使用前按照試劑瓶所示體積加入無水乙醇，混合均勻。

2、Buffer GL在較低溫度下易沉淀，若出現(xiàn)沉淀，使用前請(qǐng)?jiān)?/span>37℃加熱幾分鐘，至沉淀溶解后再使用。

3、建議使用TAE電泳分離DNA，因?yàn)?/span>TBE中的硼酸與瓊脂糖生成非共價(jià)結(jié)合的四羥基硼酸鹽復(fù)合物而降低DNA回收率。

4、盡量減少紫外照射的時(shí)間，以免損傷DNA。

5、水浴期間要間斷性搖晃離心管，加速溶膠進(jìn)行下一個(gè)步驟，減少DNA回收率的降低。

操作步驟：

1、將切割的凝膠轉(zhuǎn)入預(yù)先稱重的1.5ml離心管中，加入等體積的Buffer GL(100mg的凝膠加入100μl Buffer I)。放入55-60℃水浴中，間斷搖晃混合，直至凝膠完全融化（約5-10min），放置使其冷卻至室溫。

2、將上述混合液加入DNA回收柱內(nèi)，如果溶液體積>700μl，分次轉(zhuǎn)移溶液；室溫放置1-2min或更長(zhǎng)時(shí)間。

3、在13000g離心1分鐘，棄廢液。目的DNA長(zhǎng)度≤500bp時(shí)，離心結(jié)束后將收集管中的溶液再次轉(zhuǎn)入DNA純化柱中，離心。

4、在DNA純化柱中加入650μl Wash Buffer，13,000g離心30秒，棄廢液，將DNA純化柱放回收集管。

5、重復(fù)步驟4。

6、13000g離心3 min，以去除柱中殘余乙醇。

7、將純化柱放入新的離心管中，向柱中加入在60℃下預(yù)熱的30-50μl Elution Buffer或ddH2O，室溫放置1-2min或更長(zhǎng)時(shí)間。

注意：

a. 加入Elution Buffer后將柱子整個(gè)溫育5min后再離心洗脫可以增加DNA回收效率。

b. 對(duì)大于8Kb的片段，加溶液Elution Buffer后將柱子整個(gè)溫育15-30min可以提高回收效率。

8、13,000g離心1 min，所得液體即為高純度DNA。

儲(chǔ)存條件：室溫，有效期12個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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