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本試劑盒采用酶法破碎酵母細胞壁和堿裂解法裂解酵母細胞來提取酵母質(zhì)粒DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細胞壁，提高酵母質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的酵母質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)實驗，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。

注意：使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。YP1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2～8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

保存條件：

室溫（15℃～25℃）干燥保存，復(fù)檢期為12個月。2℃～8℃保存時間更長。

注意事項：

溶液YP1在使用前先加入RNaseA(將試劑盒中提供的RNaseA全部加入)，混勻，置于2～8℃保存。

次使用前應(yīng)按照試劑瓶標簽的說明在漂洗液中加入無水乙醇配制成工作液(向15mL的漂洗液中加入60mL的無水乙醇)。

使用前請先檢查溶液YP2和溶液YP3是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。

溶液YP2、溶液YP3和漂洗液使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子，如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機室溫下進行離心。

質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)?？截悢?shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。通常酵母質(zhì)?？截悢?shù)都很低，因此質(zhì)粒得率一般為每5mL菌液提取1μg左右。

洗脫緩沖液的體積好不少于50μL，體積過小會影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

操作步驟：

取1～5mL酵母培養(yǎng)物（不過5×107cells），12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

酵母細胞壁的破除：

酶法：向酵母菌體中加入470μLBuffer，充分懸浮菌體，加入25μL酵母破壁酶和5μL巰基還原劑，充分混勻，30℃處理1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm離心1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入250μL YP1（請先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。

注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

玻璃珠法：向酵母菌體中加入250μL YP 1（請先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。加入150～200μL酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩10min。簡短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請用YP 1補足至250μL）于另一干凈離心管中。

向離心管中加入250μL YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次使菌體充分裂解。

注意：混勻一定要溫和，以免污染細菌基因組DNA，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時間不要過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。

向離心管中加入350μL YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。

注意：YP3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。

將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50～200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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