產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒(50～100mL)	Free Endotoxin Plasmid DNA Extraction Maxi Kit(50-100mL)	10T	CS-01F96563

本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細胞中其他有機化合物。研制的內(nèi)毒素清除劑，可大限度地除去內(nèi)毒素。從50～100mL大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取200～300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達85～90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA純度高，可直接用于細胞轉(zhuǎn)染等要求較高的實驗，以及其他各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗。

注意：使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。溶液P1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2～8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

保存：常溫干燥保存，復(fù)檢期為一年。

注意事項:

使用前請先檢查溶液P2、P3和結(jié)合液是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。

洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于500μL，體積過小影響回收效率;洗脫液的pH值對洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率，DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

質(zhì)粒DNA濃度＞1mg/ml時清除內(nèi)毒素效率降低。由于質(zhì)粒DNA本身的性質(zhì)，清除過程可導(dǎo)致部分質(zhì)粒DNA丟失，但內(nèi)毒素卻能得到大限度清除。

所有溶液應(yīng)用無內(nèi)毒素的高純水配制，所有器械材料均應(yīng)不含內(nèi)毒素，玻璃器皿可高溫烘烤，非揮發(fā)性水溶液可高壓處理。

DNA濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50μg/ml雙鏈DNA、40μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7～1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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