產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
革蘭氏陽性菌質(zhì)粒小量提取試劑盒(1～5mL)	Gram-positive Bacterium Plasmid Extraction Mini Kit(1-5ml)	50T\|100T	CS-01F96561

本試劑盒用于Gram+細(xì)菌質(zhì)粒提取，一次可處理1～5mL菌液。

保存：室溫保存，復(fù)檢期一年，其中RNase A，需置于-20℃保存。

注意事項(xiàng)：

使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。

洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。

如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?/span>10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用5～10mL過夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L時(shí)間，以增加提取效率。

DNA濃度及純度檢測：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA、40μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7～1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因?yàn)?/span>pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。

操作步驟：

取1～5mL細(xì)菌培養(yǎng)物，12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

向留有菌體沉淀的離心管中加入200μL溶液Ⅰ(請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。再向其中加入50μL，混勻。37℃水浴30min以上（根據(jù)菌液量可適當(dāng)加長水浴時(shí)間）。

注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。如不能確定為何種菌，請按陽性菌處理。

向離心管中加入250μL溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次使菌體充分裂解。

注意：混勻一定要溫和，以免污染基因組DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。

向離心管中加入350μL溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，此時(shí)會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min。

注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(如果一次加不完，可分兩次吸附)。

向吸附柱中加入600μL漂洗液（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。

將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50～200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min，收集質(zhì)粒DNA溶液。

（可選）為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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