產(chǎn)品目錄

本試劑盒提供了一種簡單、快速、高效的核酸純化方法。該產(chǎn)品可用于二代測序建庫時DNA的選擇性或非選擇性回收，以及PCR產(chǎn)物的純化回收。試劑盒中的MagPure與樣品按一定比例混合后，磁珠選擇性將核酸吸附。經(jīng)兩步漂洗后，洗脫得到的DNA純度高，A260/A280的比值在1.7-1.9之間,A260/A230的比值通常在2.0以上。經(jīng)該試劑盒純化得到的DNA適用于PCR，Real-Time PCR，測序，southern blotting等實驗。

保存條件：2-8℃保存，室溫運輸。

自備儀器及試劑：

1．磁力架

2．80%乙醇。

3．洗脫液：Buffer EB (10mM Tris-HCl,pH8.0)；去離子水(pH在7.0-8.0之間)。

實驗前準備及重要注意事項：

1．冰凍、離心、聲會對MagPure中的磁珠造成不可逆的損害。

2．MagPure中磁珠長期放置后會聚集成團，從而使磁珠表面積減小，降低樣品回收得率，使用前一定要渦旋振蕩徹底混勻磁珠。

3．使用前，建議將MagPure渦旋震蕩混勻后分裝到1.5ml的離心管中，每管分裝1ml MagPure。

4．本試劑盒不適用于純化回收小于100 bp的DNA片段，如果要回收小于100 bp的DNA片段，建議將MagPure的用量增加到樣品體積的4倍。

5．進行DNA的選擇性回收時，MagPure對于DNA溶液中的離子濃度較為敏感。不同廠家的二代測序建庫試劑盒得到的接頭連接后的DNA溶液以及PCR擴增產(chǎn)物中離子濃度不同，所以用MagPure做DNA選擇性回收時，試劑用量有所不同。

操作步驟：

1．渦旋振蕩MagPure 20秒，使其徹底混勻為均一溶液。

2．向1.5ml的離心管中加入純化的DNA溶液。

3．向上一步的離心管中加入2倍樣品體積的MagPure，渦旋震蕩5秒后室溫靜置5分鐘。

4．將上一步的離心管放于磁力架上，直至磁珠完全吸附（約需5分鐘）。

5．保持離心管固定于磁力架上，徹底棄去溶液，期間避免接觸磁珠。

6．繼續(xù)保持離心管固定于磁力架上，向離心管中加入250μl新鮮配置的80%乙醇。

7．保持離心管固定于磁力架上，待懸起的磁珠完全吸附后徹底棄去乙醇。

8．重復(fù)步驟6-7兩次。

9．保持離心管固定于磁力架上靜置放置10分鐘，使乙醇完全揮發(fā)干凈。

10.將離心管從磁力架上取下，加入20-100μl EB（自備）或去離子水，渦旋振蕩使磁珠完全重懸于洗脫液中后，室溫放置5分鐘。

11.將離心管放于磁力架上直至磁珠完全吸附（約需5分鐘）。

12.將洗脫液轉(zhuǎn)移至一個新的1.5ml離心管中。此時，可棄去磁珠。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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