產(chǎn)品目錄

3.結(jié)果穩(wěn)定，產(chǎn)量高（比離心柱型的產(chǎn)量高一倍以上），OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，長(zhǎng)度可達(dá)50Kb-150kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)以及文庫(kù)構(gòu)建。

操作步驟：

1. 吸取60ml-70ml 酵母培養(yǎng)物到一個(gè)100ml 離心管；2,500 x g 離心2 分鐘，盡可能棄上清，必要時(shí)候可以用槍吸去。

2. 高速渦旋振蕩，打散重懸酵母細(xì)胞團(tuán)。

3. 加入20 ml 酵母裂解液，渦旋振蕩混勻，或者用1 毫升的槍頭反復(fù)吹打混勻。酵母細(xì)胞的重懸分散對(duì)下一步裂解非常重要，必須充分分散重懸。

4. 將裂解物放置在70℃水浴15-30 分鐘。

如果產(chǎn)量低，可以適當(dāng)提高水浴溫度和延長(zhǎng)水浴時(shí)間，中間可以渦旋振蕩混勻幾次幫助裂解。

5. 冰上至少5 分鐘使回復(fù)到室溫。

6. 在回復(fù)到室溫的裂解物內(nèi)加入6.8 ml 蛋白沉淀液后，在渦旋振蕩器上高速連續(xù)振蕩混勻25 秒?；靹蚝罂赡芤姷揭恍┬〉牡鞍讏F(tuán)塊。冰浴5 分鐘。

7. 2,500 x g(可根據(jù)需要調(diào)整加大離心力)離心5 分鐘。這時(shí)應(yīng)該可以見到管底蛋白沉淀，也可能見到一些蛋白沉淀漂浮在液體表面。

8. 小心緩慢吸取上清到一個(gè)新的100ml 離心管中，不要吸到沉淀。吸取上清時(shí)，注意不要吸到管底的和漂浮在液體表面的蛋白沉淀。如果不小心將蛋白沉淀轉(zhuǎn)入新的離心管中，可再次離心2 分鐘后取上清。

9. 加入等體積的室溫異丙醇，顛倒30 次混勻或者直到出現(xiàn)絮狀DNA 沉淀（或者白色渾濁沉淀）。

10. 2,500 x g 離心5 分鐘(可根據(jù)需要調(diào)整加大離心力)，在管底可以見到白色的DNA沉淀塊，倒棄上清。

11. 加入20ml 70％乙醇，顛倒幾次漂洗DNA 沉淀，2,500 x g 離心2 分鐘，倒去上清（注意不要把DNA 沉淀倒掉了），倒置后在吸水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇，還可以用槍頭小心吸掉管底沉淀周圍和管壁的殘留乙醇，空氣晾干沉淀幾分鐘。注意不要干燥過頭，否則DNA極其難溶；也不能殘留太多乙醇，否則乙醇可能抑制下游如酶切反應(yīng)。

12. 加入1-3ml DNA 溶解液重新水化溶解DNA 沉淀，輕彈管壁混勻，可以放置在65℃溫育30-60 分鐘（不要過一小時(shí)），也可以在室溫或者4℃放置過夜來重新水化DNA。期間不時(shí)的輕彈管壁幫助重新水化DNA。

13. 加入0.5-1ml RNase A（10mg/ml），顛倒混勻，37℃溫育30－60 分鐘去除殘留RNA。該步驟主要作用為去除殘留的RNA，如果殘留RNA多，可以適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間或者增加RNase A 用量。如果殘留RNA 不影響實(shí)驗(yàn)，可略去該步驟。如果殘留的RNA酶可能影響實(shí)驗(yàn)，也可以用等體積酚/氯仿抽提去除，然后用標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀回收DNA。

14. DNA 可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。

儲(chǔ)存條件：室溫，有效期12個(gè)月。

本制品別名：酵母DNA大量提取試劑盒|大齡酵母

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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