產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?/span>(1.5～4.5mL)	Fast Plasmid Mini Kit(1.5-4.5 ml)	50次\|100次\|200次	CS-01F96534

本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

試劑盒特點(diǎn)：

離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

快速、方便，不需要使用有毒的、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測(cè)序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)：

本試劑盒適用菌株為XL-1 Blue和DH5α等核酸酶含量低缺陷型菌株。所用菌株為JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應(yīng)購(gòu)買本公司的高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒。

所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C或者類似離心機(jī)。

溶液P3中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。一般高拷貝質(zhì)粒，建議接種單菌落于1.5～4.5mL加合適抗生素的LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)14～16個(gè)小時(shí)，可提取出多達(dá)20μg的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?/span>10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)適當(dāng)加大菌體使用量，使用5～10mL過夜培養(yǎng)物，同時(shí)按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步驟相同。

得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本螺旋可以過90%。

質(zhì)粒DNA確切分子大小，必須酶切線性化后，對(duì)比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者螺旋狀態(tài)的的質(zhì)粒，泳動(dòng)位置不確定，無法通過電泳知道其確切大小。

洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在-20℃。質(zhì)粒DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：

① 次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入量無水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

② 將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，每次使用后置于2～8℃保存。

③ 將溶液P3放在冰上預(yù)冷。

取1.5～4.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，9000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清，收集菌體。

收集過1.5mL菌液，可以離心棄上清后，在同一個(gè)1.5mL管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟1，直到收集到足夠的菌體。

用250μL溶液P1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。

如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

加250μL的溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)4～7次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。

溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時(shí)間不應(yīng)過5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準(zhǔn)確的5分鐘。

加350μL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)4～7次，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。

冰上靜置3～5分鐘，13000rpm離心10分鐘，小心取上清。

加入溶液P3后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

將上一步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13000rpm離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液。

加入500μL漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），12000rpm離心30秒，棄掉廢液。

加入500μL漂洗液WB，12000rpm離心30秒，棄掉廢液。

將吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65～70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是小體積不應(yīng)少于30μL，體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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