產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
一步法質(zhì)粒大提試劑盒(10～100mL)	One-Step Plasmid Maxi Kit(10-100mL)	5次	CS-01F96533

本試劑盒是在我司一步法質(zhì)粒(BTN70903)基礎(chǔ)上開發(fā)的、能夠快速從100mL左右的E.coli培養(yǎng)液中取質(zhì)粒DNA的產(chǎn)品。它只需要一種溶液即可以完成細菌裂解，并且裂解物可以直接上柱純化質(zhì)粒DNA。它比經(jīng)典的堿變性質(zhì)粒制備方法更加快捷和方便。

試劑盒特點：

快速，整個質(zhì)粒DNA提取過程只需要不到30分鐘，比傳統(tǒng)的堿變性方法快捷。

螺旋比例高，的非堿法一步式細菌裂解技術(shù)，避免了堿對DNA的損害，得到的質(zhì)粒DNA切口更少。

DNA純度高，幾乎沒有基因組DNA和RNA污染，OD260/280一般在1.7～1.9之間。

DNA可以直接用于電泳、酶切、PCR、細菌轉(zhuǎn)化、分子克隆等實驗。

大吸附量為600μg DNA，具體產(chǎn)率取決于質(zhì)�？截悢�(shù)。

過程簡單，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。

保存條件：

常溫運輸及保存(溶液A需要4℃保存)，有效期一年。

使用方法：

用50mL離心管分數(shù)次收集10～60mL新鮮的菌液，一般可以5000rpm

離心10分鐘，去除上清即得細菌沉淀。

往細菌沉淀中加入14mL溶液A，充分振蕩懸浮或吹打混勻。

注意：充分重懸細胞沉淀（無塊狀物）對于獲得高的質(zhì)粒產(chǎn)量十分重要。

將裂解液全部轉(zhuǎn)移到大離心吸附柱中，放入到配套的收集管中。

6000rpm離心5～10分鐘，棄穿透液。離心過濾柱將吸附溶液中的質(zhì)粒DNA，而將基因組DNA和雜質(zhì)在穿透液中。如果離心吸附柱中還有未離心下去的裂解液，可以適當延長離心時間直到離心吸附柱中沒有殘留液體。

將10mL通用預(yù)洗液加入到離心吸附柱中，室溫靜置2分鐘后6000rpm離心5分鐘，棄穿透液。

重復(fù)上步一次。

將10mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，室溫靜置2分鐘后6000rpm離心5分鐘，棄穿透液。

重復(fù)上步一次。

室溫6000rpm空甩5分鐘，棄穿透液。注意：此步很重要，不能跳過。

將離心吸附柱放入一個自備的、干凈的50mL塑料離心管中，加1mL通用洗脫液（洗脫液如加熱到50～65℃效果更佳），室溫靜置2分鐘后6000rpm離心5分鐘，收集液即是質(zhì)粒DNA溶液。

重復(fù)上步1次以便洗脫更多的質(zhì)粒DNA。

合并所得質(zhì)粒DNA，立即使用或-20℃儲存。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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