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細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分。人們在研究革蘭氏陰性菌血癥和內(nèi)毒素血癥的過程中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素在其中起著關(guān)鍵的作用，內(nèi)毒素使機(jī)體免疫功能嚴(yán)重受損，進(jìn)一步的發(fā)展可能引發(fā)膿毒性休克，彌散性血管內(nèi)凝血，急性呼吸窘迫綜合癥，全身炎癥反應(yīng)綜合癥或致命性多器官功能衰竭。因此，內(nèi)毒素的清除對于人類疾病治療的注射型藥品、生物制品等都是必須的，尤其對于基因藥物、蛋白藥物、單抗克隆藥物、治療性疫苗、小分子化學(xué)藥物等生物制品的下游純化處理來說就顯得非常重要。

試劑盒特點：

1.高穩(wěn)定性，高去除效率。

2.高結(jié)合力：> 2000,000 EU/mL。

3. pH范圍為5-10時，親和介質(zhì)對內(nèi)毒素的清除率在92%以上；pH值在7-8時，清除效率高。

4. 無需恒流泵即可調(diào)節(jié)流速。

5. 重復(fù)使用 5次不會改變柱子效果。

6. 使用方便，試劑盒中提供無熱原緩沖液，無熱原收集管及無熱原槍頭等。

7.適合純化對象為蛋白，多肽，抗體，多糖等。

8.可耐受試劑：20% DMSO，20% 乙醇，20% 甘油;1 M 尿素，300mM咪唑; 0.05% 吐溫-20，10mM DTT等。

儲存條件：常溫運輸，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

1.樣品處理：樣品的pH值和離子度在內(nèi)毒素去除的過程中起著重要作用。雖然結(jié)合內(nèi)毒素的pH范圍在6-9，但是7-8的pH范圍是純化的佳范圍。合適的離子濃度可以降低非特異性吸附，0.15-0.5 M NaCl的條件可以得到一個很好的去除效率和低的樣品損失。所以，純化之前可以使用處理過的氯化鈉，0.1 M的氫氧化鈉或0.1 M鹽酸來調(diào)節(jié)離子度或pH值。

2.活化親和介質(zhì)：將預(yù)裝柱置于鐵架臺，垂直固定，去除預(yù)裝柱頂部的蓋子，打開流速控制器，使保護(hù)液在重力作用下流干，加入5mL的(預(yù)冷)再生緩沖液，調(diào)節(jié)流速控制器，保持流速在0.25mL/min(或者10滴/min)，待再生緩沖液流干，再加入5mL 再生緩沖液，再重復(fù)操作兩次，確保體系保持無熱原(即內(nèi)毒素)存在。即使是次使用也必須進(jìn)行這一步操作。這步操作大約需要60分鐘完成。

3. 平衡親和介質(zhì)：活化完畢后，加入6mL的(預(yù)冷)平衡緩沖液，調(diào)節(jié)流速控制器，保持流速在0.5mL/min，流干平衡緩沖液，再按此操作重復(fù)兩次。這步操作大約需要40分鐘完成。

4.內(nèi)毒素清除：將流速控制器關(guān)閉，使用無熱原槍頭將樣品加入，打開控制器，控制流速不高于0.25mL/min，流出液體積達(dá)到1.5mL后，使用無熱原接收管接受樣品，樣品流干后，再加入1.5mL-3.0mL的(預(yù)冷)平衡緩沖液淋洗，收集淋洗液。檢測樣品濃度及內(nèi)毒素水平。

5. 再次使用：如果流出樣品內(nèi)毒素水平未能達(dá)到預(yù)期值，需要將預(yù)裝柱重新再生，按照步驟1 重新再生，然后上樣純化。

6. 儲存條件：如果預(yù)裝柱用完后需要保存，先用10mL 平衡緩沖液平衡柱子，待平衡液流干，加入1.5mL的再生緩沖液(含0.02%的疊氮化鈉)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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