產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
凝膠法內(nèi)毒素半定量試劑盒	Endotoxin semi-quantitative kit(Gel Method)	10×0.1mL	CS-01F96526

本試劑盒又稱鱟試劑，為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品。鱟試劑中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下(溫度，pH值及無(wú)干擾物質(zhì))，細(xì)菌內(nèi)毒素激活C因子，引起一系列酶促反應(yīng)，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。

儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸，陰涼處避光保存，有效期兩年。

使用方法：

一、樣品溶液的制備

樣品的pH值應(yīng)在6.0–8.0 之間，若出此范圍，需用無(wú)熱原緩沖液或0.1N氫氧化鈉、0.1N 鹽酸調(diào)節(jié)。若樣品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)4.2“樣品的干擾實(shí)驗(yàn)”。若樣品中可能含有導(dǎo)致鱟試劑中G 因子旁路反應(yīng)的(1,3)β－D－葡聚糖，需選用不會(huì)對(duì)(1,3)β－D－葡聚糖起反應(yīng)的特異性鱟試劑。

二：細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液及對(duì)照液的準(zhǔn)備

2.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(本試劑盒不提供)

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，按《細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品使用說(shuō)明書(shū)》配制2λ ，1λ ,0.5λ,及0.25λ的一系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(λ為鱟試劑靈敏度標(biāo)示值)。備用。

注：鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)見(jiàn)本手冊(cè)其他常用實(shí)驗(yàn)方案。

2.2 陰性對(duì)照液：即無(wú)內(nèi)毒素水。

2.3 陽(yáng)性對(duì)照液：即濃度為2λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.4樣品陽(yáng)性對(duì)照液：即添加濃度為2λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的樣品溶液。

三：內(nèi)毒素檢測(cè)

3.1 鱟試劑的溶解：按標(biāo)示量(本試劑盒為0.1mL/支)加無(wú)內(nèi)毒素水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑完全溶解。注意不要引起氣泡，溶解后的試劑應(yīng)在10 min內(nèi)使用(即配即用)。

3.2樣品溶液的制備

樣品大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的計(jì)算：

MVD＝ C?L/λ

λ：測(cè)試用鱟試劑靈敏度標(biāo)示值(EU/mL)；L：樣品細(xì)菌內(nèi)毒素限值；C：樣品濃度或樣品復(fù)溶后所得樣品濃度。當(dāng)L 單位為EU/mL(溶液)時(shí)，C的單位為1mL/mL；當(dāng)L單位為EU/mg或者EU/U時(shí)，C的單位為mg/mL或者U/mL。按照計(jì)算所得體積，加無(wú)內(nèi)毒素水制備樣品溶液。

3.3 各反應(yīng)管中分別加入0.1mL 陰性對(duì)照液，陽(yáng)性對(duì)照液，樣品，或樣品陽(yáng)性對(duì)照液。

封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37℃的恒溫器中溫育60分鐘±2分鐘，溫育期間避免振動(dòng)。

3.4 結(jié)果判斷

3.4.1 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉(zhuǎn)180°。若管內(nèi)的內(nèi)容物呈堅(jiān)實(shí)凝膠，不變形，不從管壁滑脫為陽(yáng)性，記錄為(+)；不呈凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫為陰性，記錄為(－)。

3.4.2 只有當(dāng)陰性對(duì)照管結(jié)果均為陰性，陽(yáng)性對(duì)照管、樣品陽(yáng)性對(duì)照管結(jié)果均為陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)方有效，否則無(wú)效。若陰性對(duì)照管為陽(yáng)性，提示鱟試劑、無(wú)內(nèi)毒素水或?qū)嶒?yàn)器具可能受到污染。若陽(yáng)性對(duì)照管為陰性，提示鱟試劑活性減失、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液效價(jià)降低，鱟試劑的靈敏度或內(nèi)毒素的效價(jià)標(biāo)示不準(zhǔn)確，或內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋不正確。若樣品陽(yáng)性對(duì)照管為陰性，提示反應(yīng)體系內(nèi)有干擾因素存在。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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