產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒（5～15mL）	Endo-Free Plasmid Midi Kit（5～15mL）	50次	CS-01F96519

本試劑盒通過堿裂解法裂解細胞，新型硅基質(zhì)膜高效專一的結合質(zhì)粒DNA，同時采用特殊的緩沖液系統(tǒng)和除內(nèi)毒素過濾柱，有效去除內(nèi)毒素、蛋白等雜質(zhì)。由本試劑盒所得質(zhì)粒純度高、質(zhì)量穩(wěn)定，特別適用于細胞轉(zhuǎn)染，同時也可用于DNA測序，PCR，基于PCR的突變，體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化細菌，內(nèi)切酶消化等下游實驗。

內(nèi)毒素是質(zhì)粒提取中常見的污染物，由于真核細胞對內(nèi)毒素非常敏感，因此，如果質(zhì)粒中含有內(nèi)毒素會大大降低真核細胞轉(zhuǎn)染效率。本試劑盒提供一種簡單、快捷、高效提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒的新方法，提取的質(zhì)粒大限度去除內(nèi)毒素，并能有效去除基因組DNA、RNA、蛋白等污染。

保存：室溫(15～30℃)

自備試劑：無水乙醇、異丙醇。

實驗前準備及重要注意事項：

所有組分可在干燥、室溫(15～30℃)環(huán)境穩(wěn)定保存1年，更長時間保存可置于2～8℃，加入RNase A的Buffer P1置于2～8℃可穩(wěn)定保存6個月。

次使用前，將RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混勻，置于2～8℃保存，使用前需在室溫中放置一段時間，恢復至室溫后使用。

次使用前應按照試劑瓶標簽的說明在Buffer PW中加入無水乙醇。

使用前請先檢查Buffer P2和Buffer E3是否出現(xiàn)結晶或沉淀，如有結晶或沉淀現(xiàn)象，可在37℃水浴幾分鐘，即可恢復澄清。

注意不要直接接觸Buffer P2和Buffer E3，使用后應立即蓋緊蓋子。

提取質(zhì)粒的量和純度與細菌培養(yǎng)濃度、菌株種類、質(zhì)粒大小、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關。

操作步驟：

取5～15mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管(自備)中，13000rpm(~16200×g)離心1分鐘收集細菌，盡量吸棄全部上清。

向留有菌體沉淀的離心管中加入500μL Buffer P1(請先檢查是否已加入RNase A)，使用移液器或渦旋振蕩器充分混勻，懸浮細菌沉淀。

注意：如果菌塊未徹底混勻，將會影響裂解效果，使提取量和純度偏低。

向離心管中加入500μL Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻8～10次，使菌體充分裂解，室溫放置3～5分鐘。此時溶液應變得清亮粘稠。

注意：溫和混勻，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片段。如果溶液未變得清亮，提示可能菌量過大，裂解不徹底，應減少菌體量。

向離心管中加入500μL Buffer E3，立即上下顛倒混勻8～10次，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀，室溫放置5分鐘。13000rpm離心5分鐘，吸取上清，將上清加入過濾柱FM中(已裝入收集管)，13000rpm離心1分鐘過濾，將收集管中的濾液轉(zhuǎn)移到離心管(自備)中。

注意：

① Buffer E3加入后應立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。

② 吸附柱的大容積為750μL，所以上清液請分兩次過濾，并混合于同一自備離心管中。

向濾液中加入450μL異丙醇，上下顛倒混勻。

柱平衡：向已裝入收集管的吸附柱中加入200μL Buffer PS，13000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

將步驟5中濾液與異丙醇的混合溶液轉(zhuǎn)移到平衡好的吸附柱(已裝入收集管)中。

13000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：吸附柱的大容積為750μL，所以第5步中所得溶液分多次過柱。

向吸附柱中加入750μL Buffer PW(請先檢查是否已加入無水乙醇)，13000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。

將吸附柱重新放回收集管中，13000rpm離心1分鐘。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(酶切、PCR等)。

將吸附柱置于一個新的離心管(自備)中，向吸附膜的中間部位加入100～200μL Endo-Free Buffer EB，室溫放置2～5分鐘，13000rpm離心2分鐘。-20℃保存質(zhì)粒。

注意：

① 為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2～5分鐘，13000rpm離心2分鐘。Endo-Free Buffer EB在65～70℃水浴預熱，適當延長吸附和洗脫的時間，可以增加提取效率。

② 質(zhì)?？截悢?shù)較低或>10kb時，Endo-Free Buffer EB在65～70℃水浴預熱，可以增加提取效率。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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