產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
柱式真菌DNA大量提取試劑盒(玻璃珠法)	Fungus DNA Column large-scale extraction kit(Glass bead method)	4次	CS-01F96508

本試劑盒在柱式真菌(BTN70901)基礎(chǔ)上改良而得大提升級(jí)產(chǎn)品，主要用于大量快速?gòu)母鞣N真菌材料中提取基因組DNA。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.處理量大，一次可以處理1-3g 各種真菌組織。

2. 純度高，OD260/280一般在1.8以上。不含污染和抑制劑，得到的DNA可以不經(jīng)稀釋直接用于酶切、PCR、real-timePCR、multiplex PCR、RAPD、RELP、AFLP、Southern Blotting，microsatellite analysis等各種后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3. 采用玻璃珠法破碎細(xì)胞，屬于物理方法，遠(yuǎn)比基于蝸牛酶或破壁酶的溫和化學(xué)破壁法重復(fù)性好，也不容易帶入外援真菌DNA。

4.產(chǎn)率一般在10-100μg/g真菌樣品。離心吸附柱大吸附量為800μg。

5. DNA片段長(zhǎng)度一般在20-40kb左右。

6.適用范圍廣，適用于度大多數(shù)真菌材料，包括酵母(S.cerevisiae、S.pomb、Pichia pastoris)等。

儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸,4℃保存，有效期一年。

使用方法：

1. 對(duì)菌液：取60-100mL 過(guò)夜培養(yǎng)的真菌菌液(OD600一般在1以上)到干凈的塑料離心管中，12000rpm離心2分鐘棄上清留沉淀。

2. 對(duì)菌落：用接種針在在培養(yǎng)基上刮取盡可能多的真菌菌落(約1 g)，轉(zhuǎn)移到裝有20mL 無(wú)菌水的干凈的塑料離心管中，洗滌下接種環(huán)上的菌體。12000rpm離心2分鐘棄上清留沉淀。

3. 對(duì)孢子材料，一般取1-3g左右，直接加入到離心管中，在材料中加入無(wú)菌水20mL，振蕩半分鐘后12000rpm離心2分鐘棄上清留沉淀。

4.沉淀中加入10mL溶液A和10 克的玻璃珠，渦旋震蕩10分鐘，可以延長(zhǎng)震蕩時(shí)間。

5. 加入10mL的溶液B，渦旋震蕩5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將上清液全部轉(zhuǎn)移到一個(gè)50mL的干凈的塑料離心管中。

6.在上清中加入3倍體積的溶液C，顛倒數(shù)次混勻后，分三次上離心吸附柱，每次上柱后均先室溫放置2分鐘，然后12000rpm離心1分鐘，倒掉穿透液，再次上柱，重復(fù)上面的操作，直到掛柱步驟完成。

7. 將20mL 通用洗柱液加入離心柱，12000rpm離心1分鐘，棄穿透液。

8. 重復(fù)上步操作一次。

9. 12000rpm 空甩1分鐘去除殘留液體。

10. 將離心柱放置在一新的50mL塑料離心管中，加入500μL DNA 洗脫液2.0。

11.室溫放置5分鐘后12000rpm離心1分鐘，管底即為真菌DNA樣品，吸取離心管中的DNA溶液重新滴加在吸附柱上，離心洗脫以收集更多的DNA。

12. 所得DNA可立即使用，也可長(zhǎng)期保存在－20℃。

13. 注：如離心機(jī)轉(zhuǎn)速不能達(dá)到12000rpm，可以用大轉(zhuǎn)速離心10-15min 代替12000rpm離心1-2min。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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