產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
柱式質粒DNA大提試劑盒(100～300mL)	Column Max Plasmid DNA Extraction Kit(100-300mL)	5次	CS-01F96506

本試劑盒是用于質粒DNA大量制備與純化的試劑盒。菌體先經(jīng)堿裂解法處理，再通過離心吸附柱，專一結合DNA，后洗去雜質，高效快速提取質粒DNA，全套操作可以在30分鐘之內完成。使用本試劑盒純化得到的高純度質粒DNA，可以直接用于酶切、轉化、測序及PCR等。

試劑盒特點：

快速、步驟少，整個操作在半個小時之內完成。

純度高，采用本試劑盒提取的質粒OD比值在1.8～2.0之間。

產(chǎn)量高，每毫升過夜培養(yǎng)的細菌可以提取到2～5μg/mL。

用途廣，適用于低拷貝和高拷貝質粒。

注意事項：

細菌培養(yǎng)時間一般為12～16小時，但接種量大時應減少時間。過度培養(yǎng)會降低質粒的質量甚至導致質粒DNA突變。

溶液A:溶液B:溶液C的比例為3:3:4。若細菌量增大，需按此比例放大這些溶液的使用量。

隨菌體增多應延長溶液B的作用時間，直至溶液成粘稠透明狀。但時間過長會導致質粒DNA變性。

加溶液C后形成的白色沉淀中有變性的蛋白質、細菌基因組DNA和細胞碎片，離心后應避免帶入到后續(xù)處理中。

通用洗柱液洗滌離心柱后必須甩干一次，否則殘留通用洗柱液中的乙醇會干擾后續(xù)實驗。

質粒的具體產(chǎn)量跟細菌量、質?？截悢?shù)、質粒大小和操作規(guī)范程度密切相關。100mL高拷貝的菌液一般能得到700～1500μg質粒DNA，100mL低拷貝的菌液一般能得到150～350μg質粒DNA。

純化的質粒在電泳中表現(xiàn)為2～3條帶有時甚至為4～6條帶均屬正常，未分開的環(huán)套質粒，易被誤判為基因組DNA。

使用方法：

用250mL離心管收集100～300mL菌液，5000rpm離心10分鐘，去除上清。

往細菌沉淀中加入5mL溶液A，充分振蕩懸?。ù问褂脮r需要將RNase A溶液全部加入到溶液A中并混合均勻，未用完的、含RNase A的溶液A需放4℃保存）。

注意：充分重懸細胞沉淀使之無細胞結塊狀物對于獲得高的質粒產(chǎn)量十分重要。

加入5mL溶液B，溫和翻轉10余次至藍色變得均勻。室溫放置5～10分鐘裂解細菌。

注意：避免劇烈振蕩，否則細菌基因組DNA將斷裂為小片段，與質粒難以分離，污染質粒DNA。溶液B用后需要將蓋擰緊存放，否則空氣中的二氧化碳會進入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的堿，降低其效率。如果溶液B顏色不是藍色，則表示變質，應該棄之不用并且速跟廠家聯(lián)系。

加入冰浴的7mL溶液C，顛倒混勻，此時混合液應該從藍色變成無色，如果不發(fā)生顏色變化，則表示溶液C變質，需要聯(lián)系廠家。將混合液冰上放置10分鐘，將有白色絮狀物形成。注意不要過分振蕩。

6000rpm離心10分鐘。如果離心管承受能力，離心速度還可以適當提高以充分沉淀絮狀物。

將上清液（約20mL）轉移到離心吸附柱中，放入50mL套管中。由于此時的溶液比重較大，部分沉淀物懸浮在上清液中屬正常，吸取上清時避開漂浮的沉淀物即可。

6000rpm離心5分鐘，質粒DNA將與離心吸附柱中的膜結合。棄穿透液。

將10mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，室溫靜置2分鐘后6000rpm離心5分鐘，棄穿透液。

重復上步一次，即將10mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，室溫靜置2分鐘后6000rpm離心5分鐘，棄穿透液。

室溫6000rpm空甩5分鐘，棄穿透液。注意：此步對去除殘留通用洗柱液很重要，否則通用洗柱液會影響DNA的使用。

將離心吸附柱放入一個自備的、干凈的50mL塑料離心管中，加0.5mL DNA洗脫液2.0（洗脫液如加熱到50～65℃效果更佳），室溫靜置2分鐘后6000rpm離心5分鐘，收集液即是質粒DNA溶液。

本試劑盒中的離心吸附柱吸附能力較，所以再用1mL DNA洗脫液2.0洗脫3～4次才能把絕大部分質粒DNA洗脫下來。得到的RNA可以收集在一起立即使用或存放于-80℃待用。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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