產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小提試劑盒(1.5～5mL)	Endotoxin-free Plasmid Mini Kit(1.5-5mL)	50次	CS-01F96504

本試劑盒采用菌體內(nèi)毒素清除劑，在質(zhì)粒提取前就把細(xì)胞壁上的內(nèi)毒素清除掉，徹底避免了目前通用的先提取DNA+內(nèi)毒素混合物，再從中純化質(zhì)粒DNA的弊端。用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA，內(nèi)毒素的污染濃度低，適合于轉(zhuǎn)染等對內(nèi)毒素的污染敏感的實驗。

試劑盒特點：

操作簡單，只在經(jīng)典的柱式質(zhì)粒DNA提取前，增加菌體內(nèi)毒素清除一步。

去內(nèi)毒素效果好，處理一次可以去除99%以上的內(nèi)毒素。

質(zhì)粒丟失少，產(chǎn)率只比柱式質(zhì)粒低5～10%，效果好于先提質(zhì)粒DNA，再用液相內(nèi)毒素清除劑處理的方法。

DNA可以直接用于轉(zhuǎn)染等實驗。

儲存條件：

常溫運輸及保存，有效期一年。RNase A(10mg/mL)需要低溫運輸和保存。

使用方法：

一、用菌體內(nèi)毒素清除劑清除E.coli細(xì)胞壁上的內(nèi)毒素。

收集1.5～5mL E.coli飽和菌液，12000rpm離心1分鐘，棄上清，得到細(xì)菌沉淀。

加入1mL菌體內(nèi)毒素清除劑溫和混勻后10000～12000rpm離心1分鐘，棄上清（含內(nèi)毒素）。

一次洗滌（1～2步）可以去掉90%以上的內(nèi)毒素，如果需要，可以再重復(fù)上述洗滌操作步驟3次，得到的菌體可以直接進(jìn)入后續(xù)的質(zhì)粒DNA提取步驟。

二、從無內(nèi)毒素的E.coli中提取質(zhì)粒DNA

先將全部RNase A溶液全部加入到柱式質(zhì)粒溶液A中，搖勻后再取用，未用完的柱式質(zhì)粒溶液A好在4℃保存。

在第3步所得菌液中加入250μL柱式質(zhì)粒溶液A，用槍頭充分吹打使菌體重懸（此步在冰上操作效果更佳）。

注意：細(xì)胞未充分懸浮會影響后續(xù)操作，可以使用漩渦振蕩器幫助混勻或使用Tip吸頭吹打沉淀至完全混勻。

加入250μL柱式質(zhì)粒溶液B（如果溶液B有沉淀，用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用），溫和反復(fù)顛倒混勻4～6次，看到溶液變粘即可，然后冰上放置不過4～5分鐘。

注意：此步處理不能過5分鐘，否則DNA的堿損傷比較嚴(yán)重。同時千萬不要劇烈振蕩，否則基因組DNA斷裂產(chǎn)生的片段非常容易污染質(zhì)粒DNA。溶液B用后需要將蓋擰緊存放，否則空氣中的二氧化碳會進(jìn)入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的NaOH，降低其效率）。

加入350μL冰上預(yù)冷的柱式質(zhì)粒溶液C，反復(fù)顛倒混勻4～6次，可見白色沉淀物產(chǎn)生，然后冰上放置至少5分鐘。

高轉(zhuǎn)速（12000rpm以上）4℃離心5分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大，有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正常現(xiàn)象，取上清時避開漂浮的沉淀即可。如果此步的離心在室溫進(jìn)行，更容易出現(xiàn)沉淀物漂浮的現(xiàn)象。

靜置2分鐘以讓質(zhì)粒DNA與吸附柱充分結(jié)合，此步十分重要。

室溫12000rpm離心1分鐘，棄收集管中的廢液。

加入500μL的通用洗柱液，室溫12000rpm離心1分鐘，棄收集管中廢液。

注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會揮發(fā)。

重復(fù)上步1次。

室溫12000rpm離心1分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用（如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中）。

將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管（自備）中，加入30～100μL 65～80℃預(yù)熱的DNA洗脫液2.0，室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液2.0也可以用于洗脫，但產(chǎn)量稍微有所降低。

室溫12000rpm離心1分鐘，離心管底溶液即質(zhì)粒DNA。

注：由于的吸附柱結(jié)合DNA能力較，如果再加適量DNA洗脫液2.0到離心吸附柱中，往往還能洗脫下很多質(zhì)粒DNA（相當(dāng)于次洗脫的20～30%），但注意不要使用上步得到的DNA洗脫液2.0來洗脫。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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