產(chǎn)品目錄

本試劑盒是用于質(zhì)粒DNA小量制備與純化的試劑盒。本產(chǎn)品基于改良后的堿變性法，先菌體經(jīng)堿裂解法處理使基因組DNA和質(zhì)粒DNA均變性，再用酸中和，質(zhì)粒DNA客戶快速?gòu)?fù)性，而基因組DNA不能快速?gòu)?fù)性，故可以通過(guò)離心去除，除去后含質(zhì)粒的上清用離心吸附柱吸附質(zhì)粒DNA，洗去雜質(zhì)，即可得到純化的質(zhì)粒DNA。

試劑盒特點(diǎn)：

快速、步驟少，整個(gè)操作在30分鐘左右完成。

不需要預(yù)平衡離心吸附柱。

通用洗柱液即開即用，不需要用戶額外加乙醇。

溶液B中有藍(lán)色染料，便于目測(cè)非常關(guān)鍵的堿變性和中和反應(yīng)兩步的溶液混勻狀況，保證實(shí)驗(yàn)效果。

產(chǎn)量高，一次可以處理1～4mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，每毫升過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌可以提取到2～5μg/mL（取決于質(zhì)粒是高拷貝、中拷貝還是低拷貝）。

純度高，采用本試劑盒提取的質(zhì)粒OD比值在1.8～2.0之間，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、測(cè)序及PCR等。

運(yùn)輸及保存：

常溫運(yùn)輸和保存，RNase A溶液需要-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

從篩選平板上挑取單菌落至含抗生素的培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12～16小時(shí)（搖床轉(zhuǎn)速200-300）。注意：建議使用LB培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)更豐富的培養(yǎng)基會(huì)使菌體濃度過(guò)高，過(guò)純化系統(tǒng)處理能力而降低DNA質(zhì)量。另外，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間會(huì)因細(xì)胞死亡、裂解而造成質(zhì)粒DNA濃度降低。

用1.5mL離心管收集1～4mL過(guò)夜培養(yǎng)飽和菌液，室溫12000rpm離心1分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。

次使用本試劑盒時(shí)，先將全部RNase A溶液全部加入到溶液A中，搖勻后再取用，未用完的溶液A放4℃保存。

加入250μL溶液A，用槍頭充分吹打使菌體重懸。注意：細(xì)胞未充分懸浮會(huì)影響后續(xù)堿變性，可以使用漩渦振蕩器混勻或使用槍頭吸頭吹打沉淀至完全混勻。

加入250μL溶液B（如果溶液B在低溫放置產(chǎn)生沉淀，須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用），溫和反復(fù)顛倒混勻看到溶液的藍(lán)色變得均勻并且溶液變粘即可（一般需要顛倒4～6次），然后冰上放置不過(guò)5分鐘。注意：冰上放置不要過(guò)5分鐘，否則質(zhì)粒DNA會(huì)有堿損傷。千萬(wàn)不要?jiǎng)×艺袷?，否則基因組DNA斷裂產(chǎn)生的片段非常容易污染質(zhì)粒DNA。

溶液B用后需要將蓋擰緊存放，否則空氣中的二氧化碳會(huì)進(jìn)入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的堿，降低其效率。如果溶液B顏色不是藍(lán)色，則表示變質(zhì)，應(yīng)該棄之不用并且速跟廠家聯(lián)系。

加入350μL冰上預(yù)冷的溶液C，溫和反復(fù)顛倒直到溶液顏色變成無(wú)色（一般需要顛倒混勻4～6次）。混勻后可見白色沉淀物產(chǎn)生，然后冰上放置至少5分鐘讓質(zhì)粒DNA復(fù)性。

12000rpm離心3分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大，部分沉淀物懸浮在上清液中屬正常，吸取上清時(shí)避開漂浮的沉淀物即可。如果此步的離心在4℃進(jìn)行，可減輕沉淀物漂浮。

靜置2分鐘以讓質(zhì)粒DNA與離心吸附柱充分結(jié)合，保證靜置不少于2分鐘十分重要。

室溫12000rpm離心1分鐘，棄收集管中的廢液。

加入500μL的通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫12000rpm離心1分鐘，棄收集管中廢液。注意：通用洗柱液中含乙醇，每次用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會(huì)揮發(fā)。

重復(fù)上步1次。

室溫12000rpm離心1分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留乙醇會(huì)影響DNA的后續(xù)使用（如殘留乙醇使DNA溶液在電泳上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中）。

將離心吸附柱置于一個(gè)新的1.5mL塑料離心管（自備）中，加入30～100μL 65～80℃預(yù)熱的DNA洗脫液2.0，室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液2.0也可以用于洗脫，但產(chǎn)量稍微有所降低。

室溫12000rpm離心1分鐘，離心管底溶液即質(zhì)粒DNA。

由于我公司的吸附柱結(jié)合DNA能力較，如果再加適量DNA洗脫液2.0到離心吸附柱中，往往還能洗脫下很多質(zhì)粒DNA（相當(dāng)于次洗脫的20～30%），但注意不要使用上步得到的DNA洗脫液2.0來(lái)洗脫。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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