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本Carrier RNA適用于大部分病毒RNA提取試劑盒，如的RNasy病毒RNA抽提試劑盒(離心柱式，貨號：YTB4090)。一方面可以提高微量病毒RNA在純化過程中與純化柱的結(jié)合效率和洗脫效率，另一方面可以減少被可能存在的少量殘留RNase降解的概率。Carrier RNA在病毒含量較少的情況下效果更明顯。另外，常用的EP管的材料是聚丙烯，管壁上有靜電，會吸附核酸，提取RNA時直接將Carrier RNA添加至裂解液中，Carrier RNA可以很好地被吸附到純化柱上，有效地去除靜電效應(yīng)，提高洗脫效率。

Carrier RNA主要用于微量樣本特別是病毒樣本提取RNA時，幫助提升RNA的回收效率。本Carrier RNA為非病毒來源的RNA，不會干擾病毒RNA的后續(xù)檢測。本Carrier RNA濃度為1μg/μL。

注意事項：

本產(chǎn)品-20℃保存，一年有效；-80℃保存，兩年有效。需避免反復(fù)凍融，初次使用時建議適當(dāng)分裝并于-20℃或更低溫度密封保存。

操作時應(yīng)小心，避免污染，請用RNase-free的槍頭和EP管。建議戴一次性口罩操作。

對于樣品量較少或提取病毒RNA時建議使用Carrier RNA；如果預(yù)期RNA量較大，可根據(jù)需要選擇是否加入Carrier RNA。

由于含有Carrier RNA，病毒RNA的濃度會不準確，建議使用qRT-PCR法進行定量。

使用說明：

每個病毒樣品需要2～5μg Carrier RNA，直接添加至RNA抽提試劑盒中提供的裂解液中即可。例如，一個病毒樣品，取3μL的Carrier RNA (1μg/μl)添加至300μL的裂解液中，混勻后加入到病毒樣品。

后續(xù)按照RNA抽提試劑盒的操作步驟進行RNA的提取。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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