產(chǎn)品目錄

本試劑盒可在5分鐘內(nèi)快速完成RNA純化操作，回收率可高達(dá)70～95％。該試劑盒采用高特異吸附能力的硅膠吸附柱，應(yīng)用優(yōu)化好的特定緩沖液，可選擇性地結(jié)合回收目標(biāo)RNA，并去除雜蛋白、鹽等。該試劑盒每次可純化得到高達(dá)50μg的RNA片段(>15nt)，回收的產(chǎn)物可直接用于RT-PCR、用于NGS的RNA文庫(kù)制備、基因編輯、顯微注射、RNA標(biāo)記、轉(zhuǎn)染等。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

用時(shí)短：可在5min內(nèi)完成RNA的純化。

高純度：該試劑盒采用高特異性吸附柱式純化，大程度的去除蛋白和鹽等雜志的污染。

適用性廣：適用于提取獲得的RNA、體外合成的RNA、體外合成的sgRNA等多種RNA的純化。

操作極簡(jiǎn)化：只需將樣品與Binding Buffer和無(wú)水乙醇混合，經(jīng)一步掛柱和洗脫即可獲得高純度RNA。

使用方法：

向50μL待回收樣品中加入100μL RNA Cleanup Binding Buffer用槍頭吹打混合均勻。

注意：若樣品不足50μL需加入RNase-Free H2O補(bǔ)至50μL；若樣品大于50μL則可按比例縮放緩沖液體積，當(dāng)樣品大于150μL時(shí)應(yīng)上兩根吸附柱。

向上述溶液中加入預(yù)冷150μL無(wú)水乙醇（等體積），槍頭吹打混合均勻。（當(dāng)25nt

將上述溶液共300μL加入到吸附柱中，室溫靜置30s。4℃ 13000rpm離心30s，棄去過(guò)柱液。

向吸附柱中加入預(yù)冷的700μL 75%乙醇，4℃13000rpm 30s，棄去過(guò)柱液，重復(fù)此步驟一次。

13000rpm空離2min后，將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5mL收集管中，室溫放置2min使殘留乙醇揮發(fā)。

向吸附柱芯中加入50～100μL RNase-Free H2O，室溫靜置1min后，4℃ 13000rpm離心2min，獲得的產(chǎn)物即為純化的RNA?？闪⒓词褂没蛴?/span>-80℃保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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