產(chǎn)品目錄

本試劑盒采用高效、專一結(jié)合核酸的離心吸附柱和獨特的緩沖系統(tǒng)，可從血液樣品中快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品。30-40分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)，提取的總RNA純度極高，沒有蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染。RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real-time RT-PCR、芯片分析、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等下游應(yīng)用。

產(chǎn)品特點：

·針對血液樣本獨特配置，操作更簡單、流程更優(yōu)化。

·配有高效的DNaseⅠ，可有效去除DNA污染。

·配有CS過濾柱，可有效去除其它雜質(zhì)。

· RNA純度更高，無雜質(zhì)殘留，特別適合于對純度要求很高的下游實驗。

·操作安全可靠，無需酚/氯仿抽提，無需氯化銫梯度離心，無需氯化鋰或乙醇沉淀。

保存條件：室溫（15-25℃）保存，RNase-Free DNase I,緩沖液RDD和RNase-Free ddH2O（管裝)置于2-8℃保存；加入β-巰基乙醇的裂解液RL 4℃可放置一個月；

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇

注意事項：（請務(wù)必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項)

1．操作前在RLH中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1ml RLH中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RLH 4℃可放置一個月，裂解液RLH在儲存時可能會形成沉淀，如果有沉淀出現(xiàn)，請加熱溶解后使用。

2．次使用前應(yīng)在漂洗液RW與去蛋白液RW1H中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標簽。

3．人類的血液或體液可能有潛在的感染性，所以如果對人類的全血進行處理，請注意做好防護措施。

4．本試劑盒多能處理1.5 ml健康的人類全血（健康人的全血中白細胞含量為：多4000-7000個白細胞/μl血液)，如果血液中白細胞的含量較高，可按比例減少血液的用量，本試劑盒多可處理的白細胞數(shù)量為：1×107。

5．在白細胞裂解后，該說明書中的所有步驟需在室溫（15-25℃)進行，操作速度越快越好。

6．細胞溶解物（在裂解液RLH中)可以存放在-70℃，待使用時，將其置于37℃孵育10min，以保證所有的鹽都溶解，然后進行操作步驟第7步。

7．本試劑盒不適用于凍存的全血。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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