產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
多酚多糖植物總RNA提取試劑盒	Total RNA Extraction kit from the plant in which polyphenols and polysaccharides are rich	50次	CS-01F96463

本試劑盒可從植物組織，特別是富含多糖多酚或淀粉的植物組織（如棉花葉片，成熟水稻葉片，擬南芥種子，白松松針，香蕉，枇杷葉片，馬鈴薯塊莖，蘋果，梨，西瓜果肉，獼猴桃，月季，煙草，沙棘，百合等）中快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品。提取的總RNA純度高，沒有基因組、蛋白和其它雜質的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等多種下游實驗。

產(chǎn)品特點：

·針對性：專門針對多糖多酚等難提植物樣本獨特配置，流程更優(yōu)化，結果有保障。

·高效去除基因組：配有高效DNase I，可在柱上快速去除gDNA。

·簡便快捷：僅需1小時即可完成RNA提取實驗。

·安全低毒：無需酚和氯仿等毒性有機試劑。

保存條件：室溫（15-25℃)保存。RNase-Free DNase I,緩沖液RDD和RNase-Free ddH2O（管裝)置于2-8℃保存；加入β-巰基乙醇的裂解液SL 4℃可放置一個月。

預防RNase污染，應注意以下幾方面：

1．經(jīng)常更換新手套。因為皮膚經(jīng)常帶有細菌，可能導致RNase污染。

2．使用RNase-Free的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3．RNA在本制品中時不會被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用RNase-Free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4．配制溶液應使用RNase-Free ddH2O。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%（V/V，放置過夜，高壓滅菌）。

注意事項：

1．操作前在SL中加入β-巰基乙醇至終濃度5%，如475μl SL中加入25 μl β-巰基乙醇。此裂解液好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的SL 4℃可放置一個月，裂解液SL在儲存時可能會形成沉淀，如果有沉淀出現(xiàn)，請加熱溶解后使用。

2．植物組織裂解是否充分直接影響到RNA提取的質量和產(chǎn)量，本試劑盒中提供的裂解液SL，適用于大多數(shù)植物組織的裂解，但有些植物組織（例如玉米的乳白色胚乳，紅豆種子或小麥種子）或絲狀真菌，由于次級代謝產(chǎn)物較特殊，異硫氰酸胍使樣品產(chǎn)生沉淀，導致RNA提取效果不佳的現(xiàn)象，購買試劑盒時請?zhí)嵝盐宜緲I(yè)務人員更換另一種裂解液HL，將解決該問題。

3．次使用前應在漂洗液RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標簽。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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