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本試劑盒適用于多糖、多酚及其他復(fù)雜植物組織細(xì)胞總RNA快速提取，無、氯仿RNA快速提取技術(shù)基礎(chǔ)上，又采用基因組DNA清除柱技術(shù)可以有效清除gDNA殘留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)。獨(dú)特的裂解液迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶，離心沉淀去除多糖多酚和次級代謝產(chǎn)物，然后裂解混合物用乙醇調(diào)節(jié)RNA結(jié)合吸附到基因組DNA清除柱，然后RNA被選擇性洗脫濾過，吸附在基因組DNA清除柱上的殘留DNA無法洗脫連同柱子一起丟棄從而清除掉DNA。濾過的RNA用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

本試劑盒特點(diǎn)：

1.完全不使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

2.簡捷，單個(gè)樣品操作一般可在25分鐘內(nèi)完成，簡單快速的試劑盒。

3.獨(dú)特研發(fā)成功基因組DNA清除柱技術(shù)可以有效清除gDNA殘留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)。

4.可以提取包括復(fù)雜中草藥如石斛/丹參/雪蓮/人參、復(fù)雜淀粉種子如水稻/小麥/玉米種子、復(fù)雜果實(shí)如葡萄/藍(lán)莓/草莓/西瓜果實(shí)、復(fù)雜抗逆植物如冬青/松針/沙棘/胡楊、復(fù)雜花卉月季/玫瑰/梅/牡丹花、復(fù)雜多糖植物紫菜/仙人掌/蘆薈水稻種子等數(shù)百種國內(nèi)外試劑盒提取失敗的樣品。

5.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.9～2.2，無DNA殘留,可用于熒光定量PCR、RT-PCR、芯片、二代測序、Northern-blot等各種實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)：

1. 所有的離心步驟均可在室溫完成（4℃離心也可以），使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。

2. 需要自備β-巰基乙醇，乙醇，研缽(可選)。

3. 樣品處理量絕對不要過基因組清除柱DA和和RNA吸附柱處理能力，否則造成DNA殘留或產(chǎn)量降低。開始摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時(shí)可使用較少的樣品處理量，將來根據(jù)樣品試驗(yàn)情況增加或者減少處理量。

4. 裂解液CLB和RLT Plus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時(shí)戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5. 關(guān)于DNA 的微量殘留:

一般說來任何總RNA 提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA 的微量殘留（DNase 消化也無法做到100%無殘留），本試劑盒產(chǎn)品，由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和基因組DNA 清除柱技術(shù)，絕大多數(shù)DNA 已經(jīng)被清除，不需要DNase 消化，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR 和熒光定量PCR。個(gè)別特殊情況如DNA 含量過于豐富造成殘留或者要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA 表達(dá)量分析熒光定量PCR，我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：

1) 選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。

2) 選擇基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。

3) 將RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理。本試劑盒還可以用于DNase I處理后的RNA清潔(cleanup) ，請聯(lián)系我們索取具體操作說明書。

4) 在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱上進(jìn)行DNase I柱上消化處理。購買DNA酶柱上消化試劑盒前可先索取具體操作說明書。

儲存條件：室溫，有效期12個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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