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RNase抑制劑（RNase inhibitor）是人的胎盤中存在的一種特異性核糖核酸酶(RNase)抑制劑，能夠特異地與RNase以非共價鍵結(jié)合形成復(fù)合體從而使RNase失活。該產(chǎn)品是以可溶形式在大腸桿菌中表達(dá)純化的重組鼠源RNase抑制劑，能夠廣泛抑制各種RNase (RNase A,B,C)，此外經(jīng)過RT-PCR、RT-qPCR檢驗，本品能與Reverse Transcriptase、M-MLV (H-) Reverse Transcriptase以及各種DNA Polymerase兼容。與人源RNase inhibitor相比，本品不含人源蛋白中的兩個對氧化非常敏感的半胱，因而具有更高的抗氧化活性，且更加適合于對高DTT敏感性實驗(如qPCR)。

該產(chǎn)品可用于cDNA鏈合成、多核糖體的分離(Polysome isolation)、體外轉(zhuǎn)錄和體外無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)。

活性定義：抑制5ng RNase A活性的50%所需要的酶量定義為1個活性單位(U)。RNase A的活性通過水解Cyclic 2,3-CMP生成3-CMP定量求得。

質(zhì)量控制：

核酸外切酶殘留檢測：200U本品和0.6μg λ-Hind III在74℃下反應(yīng)1小時，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。

核酸內(nèi)切酶殘留檢測：200U本品和0.6μg Supercoiled pBR322 DNA在74℃下反應(yīng)1小時，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。

大腸桿菌殘留DNA殘留檢測：50μL體系中，加入200U本品，以ddH2O為模板，擴(kuò)增E.coli 16 s rDNA基因。35個循環(huán)后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，無擴(kuò)增條帶。

儲存條件：-20℃，有效期2年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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