產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱(chēng)	英文名稱(chēng)	規(guī)格	貨號(hào)
冰凍動(dòng)植物組織RNA穩(wěn)定-過(guò)渡溶液	ICE Tissue Stabilizer	100ml	CS-01F96413

本品是一種新型的冰凍組織過(guò)渡溶液，可以幫助解凍冰凍組織，同時(shí)保護(hù)RNA完整性，從而可以使冰凍組織轉(zhuǎn)變到普通的勻漿方法易于處理的狀態(tài)，以提取高質(zhì)量的RNA。處理后的冰凍組織不需要在勻漿前將其碾磨成粉，甚至在勻漿前可以進(jìn)一步對(duì)組織進(jìn)行切割。加入RNAKeeper-ICE溶液后，組織從堅(jiān)硬的冰凍狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿彳洜顟B(tài)，此時(shí)該溶液滲入組織，使RNA酶失活。用本品溶液處理后，組織可以在室溫下操作而不用擔(dān)心RNA會(huì)發(fā)生降解。而且，樣品能被安全的稱(chēng)重，進(jìn)一步切割，或者進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)而不影響RNA的質(zhì)量。處理后的組織樣品可以直接加入到裂解溶液中破碎，也可以置于-20℃長(zhǎng)期保存。

本產(chǎn)品適用于動(dòng)物組織以及培養(yǎng)細(xì)胞、白細(xì)胞。經(jīng)測(cè)試，可用于肝、腎、脾、肺、心、胸腺、胰等組織的保存。

本產(chǎn)品與基于異硫氰酸胍的RNA提取試劑如Total RNA Extraction Reagent, Trizol，或基于離心柱的RNA提取試劑盒兼容。

應(yīng)用實(shí)例

1. 將本品在-70℃或-80℃預(yù)冷。

2. 樣品保存：

A.動(dòng)物組織：按100 mg組織比不小于1 ml 本品的比例，將冰凍組織浸沒(méi)于預(yù)冷的本品中。注意：組織塊的厚度應(yīng)不過(guò)0.5 cm，否則會(huì)影響本品的滲透效率，導(dǎo)致RNA穩(wěn)定效果變差。

B.培養(yǎng)細(xì)胞、白細(xì)胞：收集細(xì)胞，用PBS清洗后加入至少10倍體積本品，蓋緊管蓋，上下顛倒數(shù)次。此時(shí)沉淀是否被完全懸浮對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)影響。

3. 將浸沒(méi)于本品的組織轉(zhuǎn)移至-20℃存放。至少16小時(shí)后，組織即可勻漿進(jìn)入后續(xù)提取過(guò)程；若不立即勻漿，組織可繼續(xù)在-20℃穩(wěn)定存放6個(gè)月。這個(gè)過(guò)程中，組織可從溶液中取出，在室溫進(jìn)行切割、稱(chēng)重等操作(注意在室溫暴露的時(shí)間不要過(guò)30分鐘)后繼續(xù)浸沒(méi)在本品中保存。

4. RNA提�。簩⒔M織取出，用鑷子輕輕擠掉多余的本品溶液，置于裂解液中，立刻勻漿。如果是細(xì)胞樣品，10000g，4℃離心1分鐘，棄上清，加入裂解液。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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