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本產品是一種用于各種動植物、細菌組織/細胞總RNA抽提的試劑，具有的裂解能力，可在短時間內裂解細胞和組織樣本，保持樣品中RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。樣品在該試劑中能夠充分被裂解，在加入氯仿離心后，溶液會形成上清層、中間層和有機層 (鮮紅色下層)，RNA分布在上層水相中，收集上清層后，經異丙醇沉淀便可回收得到Total RNA。提取的總RNA純度高，基本不含蛋白質及基因組DNA，可直接用于Northern、點雜交、mRNA純化、體外翻譯、RT-PCR、poly(A)+選擇、RNA酶保護分析以及構建cDNA文庫等多種分子生物學實驗。

此外，在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。

本品操作簡單快速，所有操作可以在一小時內完成。且對少量的組織(50-100mg)和細胞(5×106)以及大量的組織(≥1g)和細胞(>107)均有較好的裂解效果。

注意事項

1）需自備氯仿、異丙醇（新開封或提取RNA專用）、75%乙醇 (DEPC水配制)、DEPC和DEPC水。

2）戴一次性干凈手套；在單獨的潔凈的區(qū)域操作；在操作過程中避免講話，以防實驗者汗液、唾液中的RNase的污染。

3）請盡量使用RNase free的實驗器具，包括槍頭和離心管。耐高溫器物可150℃烘烤4小時以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考慮用0.1% 的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。RNA實驗用的器具和試劑應專門使用，不要用于其它實驗。DEPC水建議分裝后保存。

4）本產品中含有，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內、接觸皮膚、吞食等會中毒、導致灼傷以及其他身體傷害。使用本產品時應穿戴防護物品，如裝、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接觸到眼睛時，應立即用大量的水沖洗以及前往醫(yī)院治療；

5）樣品用Total RNA Extraction Reagent 勻漿后，如果不即刻加入氯仿進行下游實驗，可先于-70℃下凍存，可保存一個月以上。另保存在75%乙醇中的RNA沉淀，可于4℃保存1周，-20℃保存1年。

6）RNA半衰期比較短，易降解，建議抽提后盡快進行后續(xù)實驗。

儲存條件：4℃，避光，有效期一年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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