產(chǎn)品目錄

分子生物學(xué)實驗中，常利用銀染的方法顯示聚丙烯酰胺凝膠或者瓊脂糖凝膠中的核酸條帶，其檢測原理是：銀離子(Ag+）可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物，隨后Ag+ 在堿性環(huán)境下被還原劑如甲醛還原成銀顆粒，后者通過顯色可把核酸電泳條帶染成黑褐色。該方法檢測靈敏度比EB高達(dá)200倍，常用于檢測SSR標(biāo)記、SNP標(biāo)記等。

常規(guī)的銀染方法由固定、氧化、染色、顯影、終止等若干個步驟組成，操作十分繁瑣，尤其不適用于大批量實驗。而本品的推出可大大改善上述問題，主要體現(xiàn)在：1）快速，整個過程僅需20分鐘；2）操作簡單，只有染色和顯影兩步；3）靈敏度跟常規(guī)方法相當(dāng)，比EB高200倍，能檢測到10ng的DNA條帶。4）兩個成分都是現(xiàn)用現(xiàn)配，可重復(fù)性好。

按照本方案提供的配制方法，共可配制試劑A和試劑B分別1000ml。

產(chǎn)品組份：

組分名稱規(guī)格

試劑A 1 2g

試劑A 2（10×） 100ml

試劑A 3（10×） 100ml

試劑B 1（10×） 100ml

試劑B2 5ml

注意事項：

1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2）銀染主要出現(xiàn)在PAGE膠的表面，因此該方法更適合用于薄膠（0.5-0.75mm）的檢測。

3）染色過程中，緩慢的振蕩是必要的，一般選擇40-60 rpm。

4）凝膠表面的裂紋多是由于壓力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都應(yīng)帶手套。

5）PAGE凝膠背景呈均一的黑色多是水中的雜質(zhì)引起的，所以溶液的配制應(yīng)使用電導(dǎo)率小于1 μS的去離子水。

6）如果染色后有呈灰塵或煙霧狀灰色或棕色的沉淀出現(xiàn)在凝膠表面，可能是幾步漂洗過程不夠徹底，或染色過程溫度太低。

7）較深的銀染背景多是丙烯酰胺中的雜質(zhì)所致。

8）室溫操作時，溫度的波動往往會干擾銀染的效果，恒溫水浴可以解決這個問題。

9）染色使用的玻璃器皿必須非常干凈，用酸浸泡可以滿足要求。

10）銀染應(yīng)盡快照相，隨著時間延長，蛋白條帶會變淺，而背景會加深。

11）影響硝酸銀染色效果的因素很多，其使用容器的材質(zhì)也是一個非常重要的因素。通常玻璃平皿是理想的銀染容器，其化學(xué)性質(zhì)極其穩(wěn)定，幾乎不與銀染試劑中的任何成分發(fā)生反應(yīng)，且不具有吸附染料的特性。其次是醫(yī)用搪瓷盤，瓷釉為無機(jī)玻璃質(zhì)材料，能耐各種濃度的無機(jī)酸(包括氧化性酸)、有機(jī)酸、弱堿和有機(jī)溶劑，但不耐酸、堿介質(zhì)交替使用，而常規(guī)銀染法就是酸堿介質(zhì)交替使用，因此搪瓷盤銀染效果不如玻璃平皿。塑料種類較多，如果塑料是由含氨基官能團(tuán)的有機(jī)物（脲、三聚氰胺或苯代三聚氰胺）與醛類（主要是甲醛）化合物經(jīng)縮聚反應(yīng)而得，則這種塑料會在堿性溶液中與有還原作用的甲醛發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而使甲醛消耗，減弱銀離子與蛋白的結(jié)合，降低顯色敏感度和顯色速度。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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