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本試劑盒適用于凍存和新鮮的抗凝全血樣本中提取血液中小RNA(＜200nt)，具有操作步驟簡單、重復(fù)性好、產(chǎn)率較高的特點(diǎn)。核酸提取的成功與否、提取質(zhì)量的好壞對后續(xù)實(shí)驗(yàn)起著至關(guān)重要的作用。使用TRIzol試劑提取總RNA，對總RNA中包含的部分小RNA進(jìn)行研究，該方法的缺點(diǎn)是總RNA中microRNA的比例較小，同時(shí)由于mRNA的干擾，會導(dǎo)致后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和RealTime PCR實(shí)驗(yàn)效率很低，很難獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且結(jié)果不可靠。在探索miRNA分子功能的過程中開發(fā)的全血miRNA提取試劑盒，通過一步上柱即可獲得純度高達(dá)98%的不含大RNA的miRNA，而且可在45分鐘內(nèi)完成小RNA的提取。每150μL全血可獲得~1μg的microRNA。

保存：室溫可保存2年。

注意：miRNA Reagent A溶液中含有胍鹽，其具有烈的腐蝕性，試驗(yàn)時(shí)請務(wù)必佩戴防護(hù)眼鏡、手套、口罩等防護(hù)措施，如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗，再另行就醫(yī)。

自備試劑：

異丙醇、乙醇、75%異丙醇

操作方法：

向1.5mL EP管中加入300μL miRNA Reagent A。將150μL抗凝全血加入到上述300μL miRNA Reagent A中，立即手腕用力震蕩混合均勻。室溫靜置5分鐘以充分裂解細(xì)胞。

向上述裂解完畢的裂解液中加入250μL miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13000rpm離心5分鐘，吸取550μL上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5mL EP管中。

向上述溶液中加入200μL無水乙醇，手腕用力震蕩數(shù)次，室溫放置5分鐘。

13000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移700μL上清液到新的1.5mlEP管中。

向上述溶液中加入300μL異丙醇，手腕用力上下顛倒數(shù)次。

分兩次將上述溶液倒入到miRNA吸附柱中，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。

向吸附柱中加入700μL 75%異丙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。

向吸附柱中加入500μL無水乙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過濾液。

吸附柱13000rpm空離心2分鐘，去掉殘留的乙醇。

將吸附柱放入到新1.5mL EP管中，室溫放置2分鐘，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入30μL RNase-Free TE Buffer，室溫靜置2分鐘，13000rpm離心2分鐘，洗脫產(chǎn)物即為提取的miRNA。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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