產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
RNA/mircoRNA/DNA/蛋白分提試劑盒	AllExtract Tissue/Cells RNA/mircoRNA/DNA/Protein Isolation Kit	50次	CS-01F96385

本試劑盒用于快速從動物細胞或者組織樣品中同時提取分離基因組DNA、總RNA和蛋白(如選購microRNA吸附柱和配套溶液，還可以將同一個樣品的總RNA中的microRNA分離并提取，富集microRNA)。得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗?；蚪MDNA也可以直接用于下游的Southern、酶切、PCR等各種試驗。

本試劑盒采用獨特的裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNase、DNase，然后裂解混合物通過一個基因組DNA吸附柱，基因組DNA被吸附而RNA和蛋白穿透濾過。DNA吸附柱上基因組DNA經(jīng)過一系列漂洗、離心后，洗脫得到純凈基因組DNA。濾過的RNA用乙醇調節(jié)結合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于RNA吸附柱上，再通過一系列快速的漂洗、離心洗脫得到純RNA。濾液經(jīng)選擇性沉淀得到蛋白。

試劑盒特點：

完全不使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

快速，簡捷，單個樣品總RNA、基因組DNA和蛋白分離操作一般可在1小時內(nèi)完成。

獨特的吸附柱和配方確保有效清除基因組DNA殘留，一般情況下得到的RNA不需要DNase消化可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

多次柱漂洗確保RNA、基因組DNA高純度，可直接用于下游各種實驗。

試劑盒組成：

組分規(guī)格

裂解液RLT Plus 50mL

Wash Solution 1 12mL

Wash Solution 2/3 10mL

RNase-free H2O 10mL

抑制物去除液IR 25mL

漂洗液WB 15mL

緩沖液APP 60mL

洗脫緩沖液EB 10mL

基因組DNA吸附柱DA和收集管 50套

RNA吸附柱RA和收集管 50套

保存：RT，有效期12個月

保存注意事項：

所有的溶液應該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清。

不合適地保存于低溫（4℃或者-20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下（15～25℃）進行。

避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

注意事項：

所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C或者類似離心機。

樣品處理量絕對不要過基因組吸附柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或者產(chǎn)量降低。不同組織細胞種類RNA/DNA相差極大，例如胸腺脾臟DNA含量豐富，過5mg就會過柱子處理能力。COS細胞RNA含量豐富，過3×106細胞就會過柱子吸附能力。所以開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時寧可使用較少的樣品處理量，如細胞不過3～4×106，組織不過10mg。將來根據(jù)樣品試驗情況增加或者減少處理量。

裂解液RLT Plus、抑制物去除液IR、Wash solution 1、Wash solution 2/3中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

該試劑盒如需要用于植物樣品尤其是多糖多酚次級代謝產(chǎn)物豐富的困難樣品的DNA、RNA提取，請咨詢我司技術人員，可能需要用到其它試劑。

額外購買microRNA吸附柱子和配套溶液，還可以將同一個樣品的總RNA和microRNA分離并提取，富集microRNA。如有需要請咨詢我公司。

關于DNA的微量殘留：

一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），本公司的AllExtract組織細胞RNA/DNA/蛋白分提試劑盒，由于采取了本公司獨特的緩沖體系和基因組DNA分離清除技術，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR和熒光定量PCR。個別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行模板和引物的選擇時：

選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應。

選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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