產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱(chēng)	英文名稱(chēng)	規(guī)格	貨號(hào)
超純血液總RNA提取試劑盒(TRIzol法)	Ultra Pure Total RNA Extraction Kit From Blood	20次\|50次	CS-01F96381

本試劑盒本試劑盒適用于快速提取全血高純度總RNA。采用改進(jìn)的異硫氰酸胍/酚一步法(TRIzol法)裂解細(xì)胞和滅活RNA 酶，然后總RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，后低鹽的RNase free water將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品組分：

組份 20次

10X紅細(xì)胞裂解液RLB 10ml

裂解液RL 25ml

去蛋白液RE 15ml

漂洗液RW 5ml

RNase-free H2O 10ml

70%乙醇 4ml RNase-free H2O

吸附柱 20個(gè)

收集管（2ml） 20個(gè)

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2. 結(jié)合了異硫氰酸胍/酚一步法試劑穩(wěn)定性好，純度高和離心柱方便快捷的優(yōu)點(diǎn)，不需要異丙醇沉淀和乙醇洗滌過(guò)程，RNA可以直接從離心柱上洗脫避免了過(guò)度干燥不易溶解問(wèn)題。

3. 獨(dú)特的RL裂解液配方，可以有效的消除基因組污染。

4. 多次漂洗去蛋白過(guò)程，提取RNA純度更高。

5. 有效的去除了5S在總RNA中含量，提高了純度。

注意事項(xiàng)：

1. 次使用前請(qǐng)先在漂洗液瓶和70%乙醇瓶中加入量乙醇，加入后請(qǐng)及時(shí)打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

2. 所有離心步驟如未加說(shuō)明，均在室溫進(jìn)行。使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類(lèi)似離心機(jī)。

3. 裂解液RL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4. 考慮到環(huán)保問(wèn)題，本試劑盒不含有實(shí)驗(yàn)室常用試劑氯仿，用戶使用前需要自備氯仿。

5. 常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳和變性膠電泳均可以用來(lái)分析RNA的質(zhì)量。好的RNA產(chǎn)物在電泳后應(yīng)該可以看到明顯的二條優(yōu)勢(shì)核糖體RNA帶，分別為~5Kb（28S），~2Kb

（18S），條帶亮度比值約為2：1。有時(shí)候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S，tRNA)帶。但有時(shí)候根據(jù)不同的物種如某些植物組織可以看到4，5條帶也屬于正常現(xiàn)象，如果RNA未成熟的前體或者不均一核RNA、小核RNA提取出來(lái)也可能看到介于7Kb和15Kb之間的不連續(xù)的高分子量條帶。

6. 檢測(cè)OD260/OD280吸光度比值時(shí)，RNA樣品應(yīng)該溶于TE后檢測(cè)，如果用水稀釋后檢測(cè)，由于一般水離子度和PH值低，會(huì)使OD280升高，從而使比值降低。

7. 加入裂解液RL勻漿后，加氯仿前，樣品可在–60℃-70℃ 保存一個(gè)月以上。

8. 關(guān)于DNA的微量殘留：

一般說(shuō)來(lái)任何總RNA 提取試劑在提取過(guò)程中無(wú)法完全避免DNA 的微量殘留, 在大多數(shù)RT-PCR 擴(kuò)增過(guò)程中極其微量的DNA 殘留（一般電泳EB 染色紫外燈下觀察不可見(jiàn)）影響不是很大, 如果要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA 表達(dá)量分析如熒光定量PCR,我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：

1) 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過(guò)mRNA 中的連接區(qū),這樣DNA 就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。

2) 選擇基因組DNA 和cDNA 上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。

3) 將RNA 提取物用RNase-free 的DNase I 處理。

4) 在步驟去蛋白液RE 漂洗前，直接在吸附柱上進(jìn)行DNase I 消化處理。

儲(chǔ)存條件：室溫，有效期12個(gè)月。(裂解液RL需4℃避光保存)

本制品別名：全血RNA提取試劑盒|血液RNA提取試劑盒|全血總RNA提取試劑盒

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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