產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
組織細(xì)胞總RNA提取試劑盒	Total RNA Extraction Kit From Cell & Tissue	50次	CS-01F96377

本試劑盒適用于快速提取動物細(xì)胞和易裂解動物組織總RNA，是在無、氯仿RNA快速提取技術(shù)基礎(chǔ)上，又采用基因組DNA清除柱技術(shù)確保有效清除gDNA殘留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)。獨(dú)特的裂解液迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶，然后裂解混合物通過一個基因組DNA清除柱，基因組DNA被清除而RNA穿透濾過。濾過的RNA用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后,RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

完全不使用有毒的，氯仿，β巰基乙醇等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

快速，簡捷，單個細(xì)胞樣品操作一般可在15分鐘內(nèi)完成。

基因組DNA清除柱技術(shù)確保有效清除gDNA殘留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)。

多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)2.1-2.2（100%純的RNA比值一般是2.2左右，很多公司的產(chǎn)品因?yàn)闅埩舻鞍谆蛘?/span>DNA較多，造成比值降低，無法達(dá)到2.2這個純度標(biāo)準(zhǔn)，因此降低要求1.9-2.0就湊合使用了，但是本試劑盒的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)一般可以達(dá)到高水準(zhǔn)的2.1-2.2的純度標(biāo)準(zhǔn)）。

試劑盒組分：

組份 50次

裂解液RLT Plus 50ml

去蛋白液RW1 40ml

漂洗液RW 10ml

(次使用前按說明加量乙醇)

RNase-free H2O 10ml

70%乙醇 9ml

(次使用前按說明加量乙醇)

基因組DNA清除柱和收集管 50套

吸附柱和收集管 50套

儲存：

所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時溶液可能形成沉淀，此時不應(yīng)該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

不合適的儲存于低溫（4℃或者－20℃）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運(yùn)輸和儲存均在室溫下（15℃－25℃）進(jìn)行。

避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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