產(chǎn)品目錄

本品是從細菌中分離的重組人RNase Inhibitor，其分子量為50 KD，能通過與RNase A 1:1形成非共價的復(fù)合體而抑制后者的活性，Ki為3×10-14M，該反應(yīng)是可逆的，通過尿素及硫基類試劑能夠解離復(fù)合體，使RNase復(fù)活而抑制劑不可逆失活。本品屬蛋白質(zhì)性質(zhì)，與其它競爭性抑制劑(核酸類、無機磷酸類)不同，可以很容易地通過處理將其從反應(yīng)體系中除去。本制品濃度為40U/μL.

產(chǎn)品特點：

1．抑制范圍廣，可以抑制RNase A、RNase B、RNase C等RNase的活性，但不能抑制RNase T1、RNase H、S1 RNase和Aspergillus RNase的活性。

2．與SP6、T3和T7 RNA polymerase、AMV和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶等兼容。

3．在廣泛的pH范圍(pH5～8)有活性。

4．應(yīng)用范圍廣，可以用于RT-PCR、cDNA合成、in vitro transcription or translation等需要抑制RNase活性的酶反應(yīng)中。

儲存條件：低溫運輸，-20℃及保存，有效期一年。

使用方法：一般在有RNA的反應(yīng)體系中加1～10U即可。

質(zhì)量控制：無DNase、RNase、endonuclease and Nickase污染。

活性單位定義：抑制5ng RNase A 50%的活性所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。RNase A的活性通過水解Cyclic 2'，3' -CMP定量求得。

貯存液：20mM HEPES-KOH (pH7.6 at 4℃)，50mM KCl，8mM DTT和50%(v/v) glycerol。如果經(jīng)常打開存儲的離心管，則需要補加DTT。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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