產(chǎn)品目錄

本試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質(zhì)總RNA，也適用于真菌菌絲RNA的提取。獨特的Shredder分離柱，用于勻質(zhì)化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時采用硅基質(zhì)膜吸附RNA進行純化，使多聚糖等各種污染物通過洗滌被有效去除，經(jīng)洗脫的RNA可直接用于各種下游實驗。由本試劑盒提取RNA分子量大于200堿基，純度高，幾乎無DNA殘留。如果是對微量DNA非常敏感的RNA實驗，殘留的DNA可利用無RNase的DNase在柱上進行消化去除。提取的RNA可用于Northern Blot、Dot Blot 、RT-PCR和體外翻譯等實驗。

保存條件：DNase I及10×Reaction Buffer -20℃保存，其它組分室溫(15～30℃)。

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)。

實驗前準(zhǔn)備及重要注意事項：

1、預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

① 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

② 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

③ 操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2、預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

① 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

② 玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底沖洗后高壓滅菌。

③ 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

④ 操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

3、提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響RNA提取的量和質(zhì)量。

4、Buffer RL在使用前請加入β-巰基乙醇，1ml Buffer RL加10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer RL室溫可保存1個月。Buffer RLC使用時不需加β-巰基乙醇。

5、次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在Buffer RW2中加入無水乙醇。

6、Buffer RL和Buffer RLC如果產(chǎn)生沉淀，請加熱使其溶解后室溫放置。

7、所有離心步驟均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

在線咨詢

留言注意事項：

1.遵守中華人民共和國有關(guān)法律、法規(guī)，尊重網(wǎng)上道德，承擔(dān)一切因您的行為而直接或間接引起的法律責(zé)任。

2.請您真實的反映產(chǎn)品的情況,不要捏造、誣蔑、造謠。如對產(chǎn)品有任何疑問,也可以留言咨詢。

3.未經(jīng)本站同意，任何人不得利用本留言簿發(fā)布個人或團體的具有廣告性質(zhì)的信息或類似言論。

您感興趣的產(chǎn)品*
您的單位*
聯(lián)系人*
聯(lián)系電話*
詳細(xì)地址*
常用郵箱*
請輸入您對我們的意見或建議*
驗證碼*