產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
血清血漿尿液游離RNA提取試劑	RNAtiqu Circulating RNA Extraction Reagent	50ml	CS-01F96323

本品特別適用于從血清、血漿中分離純化包括microRNA和其他小RNA(<200nt)在內(nèi)的總RNA。本品靈活處理不同起始量的樣品，在有效裂解樣本的同時(shí)，可有效保存RNA的完整性，提取的總RNA完整性好，無蛋白和DNA污染，提取的RNA可用于RT-PCR、Northern Blot和分子克隆等下游實(shí)驗(yàn)。

自備試劑：氯仿、異丙醇、75%乙醇、無RNase的水(新開封或提取RNA專用)。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)：

1、預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

① 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

② 玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底沖洗后高壓滅菌。

③ 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

④ 操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。

2、提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響RNA提取得率和質(zhì)量。

3、本品中含有，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會(huì)導(dǎo)致中毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)物品，如裝、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接觸到眼睛，應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。

4、樣品用游離RNA(血清血漿尿液)提取試劑勻漿后，如不即刻加入氯仿，置于-70℃可放置一個(gè)月以上。

5、保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2～8℃可以保存一周，-20℃條件下可以保存1年。RNA半衰期比較短，容易降解，建議提取后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Northern Blot等。

6、若下游實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA非常敏感，建議用不含RNase的DNase I對(duì)RNA進(jìn)行處理。

操作步驟：

1、取200μl新鮮或者凍存的血清或血漿，加入3倍體積的游離RNA(血清血漿尿液)提取試劑。振蕩30秒，充分混勻。

注意：樣本加入游離RNA(血清血漿尿液)提取試劑后，可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，經(jīng)過振蕩混勻后，沉淀基本消失。若仍有少量沉淀，不影響下游實(shí)驗(yàn)，可繼續(xù)操作。

2、將處理后的樣品在室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離。

3、向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml血清/血漿樣本專用總RNA提取試劑加入0.2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘。

注意：如不能渦旋混勻，可手動(dòng)快速顛倒混勻2分鐘。

4、4℃ 12000rpm離心20分鐘，此時(shí)樣品分成三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無色水相，RNA 主要在水相中，把水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的無RNase的離心管(自備)中。

5、在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置30分鐘?；?/span>-20℃沉淀過夜，效果更佳。

6、4℃ 12000rpm 離心20分鐘，棄上清。

注意：離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。

7、加入75%乙醇(用無RNase的水配制)洗滌沉淀。每使用1ml游離RNA(血清血漿尿液)提取試劑加入1ml 75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。

8、4℃ 12000rpm離心3分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄RNA沉淀。

注意：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。

9、室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30-100μl無RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要過分干燥，以免難于溶解。

儲(chǔ)存條件：2～8℃。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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