中文名稱：Protein A/G免疫沉淀磁珠試劑盒
英文名稱：Protein A/G Immunoprecipitation Kit
產(chǎn)品規(guī)格：20次/100次
發(fā)貨周期：1～3天
產(chǎn)品簡介：
Protein A/G Matrix免疫沉淀磁珠及試劑盒系列產(chǎn)品是利用納米表面技術(shù)使Protein A/G高密度定向包被到超順磁性微球表面，與當(dāng)前國際免疫磁珠市場上同類產(chǎn)品相比，該產(chǎn)品具有更多的抗體結(jié)合位點(diǎn)，磁珠使用量更少，非特異性結(jié)合率低，可便捷高效地進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。每毫升免疫沉淀磁珠結(jié)合Human IgG的能力可達(dá)到300 μg以上，單個沉淀反應(yīng)僅需25 μL磁珠即可完成檢測。微米級磁珠提供的超大比表面積，大幅縮短抗體與抗原吸附所需的平衡時(shí)間，15 min內(nèi)即可完成抗體吸附過程，30 min內(nèi)完成抗原沉淀操作。簡短的操作時(shí)間避免長時(shí)間操作造成目標(biāo)蛋白水解，保證了目標(biāo)蛋白的活性及蛋白復(fù)合物的完整性。
免疫沉淀磁珠試劑盒配有經(jīng)過優(yōu)化預(yù)制的緩沖液，為免疫沉淀實(shí)驗(yàn)提供了最佳的反應(yīng)條件，增強(qiáng)了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。
本產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞裂解物、細(xì)胞分泌上清、血清、腹水等樣品中抗原的免疫沉淀反應(yīng)。操作者可以參考本操作說明書，附表1的數(shù)據(jù)了解不同種屬來源及亞型的抗體與Protein A磁珠、Protein A/G的結(jié)合能力。
儲存條件：2～8℃保存
保存期：1年
注：磁珠結(jié)合Human IgG能力(Antibody Capacity)分別為：Protein A：0.4～0.5 mg/mL; Protein A/G：0.5～0.6 mg/mL
操作流程：
1. 抗原樣品制備：本操作說明書提供以下四種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來源的抗原樣品選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行預(yù)處理，使待檢測抗原釋放至樣品溶液中。
血清樣品處理：若目標(biāo)蛋白豐度較高，建議用結(jié)合緩沖液(②)稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為10～100 μg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
懸浮細(xì)胞樣品處理：離心收集細(xì)胞(4℃，500 g，10 min)，棄上清后稱重，按每毫克細(xì)胞50 μL的比例用1× PBS(③)洗滌2次；按每毫克細(xì)胞5～10 μL 的比例加入結(jié)合緩沖液(②)，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為1 mM 的PMSF)，混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液(4℃,14000 g,10 min)，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
貼壁細(xì)胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，按每1.0×105個細(xì)胞150 μL的比例用1×PBS(③)洗滌兩次；用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞，收集至1.5 mL EP管內(nèi)，按每1.0×105個細(xì)胞20～30 μL 的比例加入結(jié)合緩沖液(②)，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為1 mM的PMSF)，混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液(4℃，14000 g，10 min)，置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。
大腸桿菌樣品處理：離心收集大腸桿菌(4℃，12000 g，2 min)，棄上清后稱重，按每克(濕重)菌體 10 mL的比例用1×PBS(③)洗滌2次；按每克(濕重)菌體5～10 mL的比例加入結(jié)合緩沖液(②)，同時(shí)加入蛋白酶抑制劑(如終濃度為1 mM 的PMSF)，重懸菌體，超聲裂解細(xì)胞，離心收集上清(4℃，17000 g，10 min)。
2. 磁珠預(yù)處理：將免疫沉淀磁珠(①)漩渦振蕩1 min，使磁珠充分振蕩重懸；取25～50 μL磁珠懸液置 于1.5 mL EP管中。加入200 μL 結(jié)合緩沖液(②)洗滌，進(jìn)行磁性分離［將EP管放置于磁性分離器(⑦)上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；該操作描述以下省略］，棄上清液，從磁性分離器上取下EP管，重復(fù)洗滌一次。最后加入200 μL 結(jié)合緩沖液(②)重懸磁珠以備用。
3. 抗體結(jié)合反應(yīng)：
抗體工作液的制備：用結(jié)合緩沖液(②)稀釋抗體樣品，配制成終濃度為5～50 μg/mL抗體工作液，置于冰上備用。
抗體吸附：將步驟2預(yù)處理的磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，棄上清液；加入200 μL抗體工作液，迅速重懸后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)EP管，15 min后進(jìn)行磁性分離，收集上清液置于冰上以備后續(xù)檢測。
洗滌：向EP管中加入200 μL 結(jié)合緩沖液(②)洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液，從磁性分離器上取下EP管。重復(fù)以上洗滌操作一次。
4. 抗體交聯(lián)反應(yīng) (備選)：如操作者需要將抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物共同洗脫，請忽略本步驟，進(jìn)行步驟5。
本步驟適用于操作者需要單獨(dú)洗脫目標(biāo)抗原的試驗(yàn)，推薦使用BS3(Thermo Scientific，Cat. #21580)作為交聯(lián)劑，相關(guān)實(shí)驗(yàn)請參照該試劑的操作說明。
5. 抗原沉淀反應(yīng)
抗原吸附：加入200 μL步驟1中制備的抗原樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散。在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)EP管10 min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng)1 h或者在4℃下反應(yīng)過夜。
洗滌與轉(zhuǎn)移：將上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行磁性分離，收集上清液置于冰上以備后續(xù)檢測。向EP管中加入200 μL洗滌緩沖液(④)洗滌，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行磁性分離，棄上清液；從磁性分離器上取下EP管，再重復(fù)洗滌兩次。最后加入200 μL 洗滌緩沖液(④)，用移液器將磁珠-抗體-抗原復(fù)合物懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中*，并執(zhí)行磁性分離，移棄上清。
(*注：抗原洗脫前務(wù)必將磁珠轉(zhuǎn)移到新的EP管，避免將管壁上原有的非特異性吸附蛋白一起洗脫。)
6. 抗原洗脫：本操作說明書提供以下兩種抗原洗脫方案，操作者可根據(jù)后期檢測的需要選擇不同的抗原洗脫方法。
變性洗脫法：此法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。從磁性分離器上取下EP管，向其中加入25 μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer(自備)混合均勻，95℃加熱5 min。然后執(zhí)行磁性分離［也可以使用離心的方式(室溫下13000 g，10 min)］收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。
非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。從磁性分離器上取下EP管，向其中加入20 μL洗脫緩沖液(⑤)混合均勻，室溫孵育10 min。然后執(zhí)行磁性分離［也可以使用離心的方式(4℃，13000 g,10 min)］，收集上清液至新的EP管，并立即加入1.0 μL中和緩沖液(⑥)將洗脫產(chǎn)物pH調(diào)節(jié)至中性，用于后期功能分析。
注意事項(xiàng)：
1. 進(jìn)行免疫沉淀操作之前，請務(wù)必認(rèn)真閱讀本操作說明書。
2. 本產(chǎn)品須與磁性分離器配套使用。
3. 磁珠使用前應(yīng)充分振蕩均勻。
4. 磁珠應(yīng)保存在儲存溶液中，防止干燥。
5. 請勿將磁珠冷凍或離心，以免引起不可逆聚集。
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