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中文名稱：ECM Kit(大鼠IgG)

英文名稱：

產(chǎn)品規(guī)格：1盒

發(fā)貨周期：1～3天

用途：適于一抗為大鼠IgG的Western Blotting 檢測(cè)。

保存條件：4℃可保存一年。

實(shí)驗(yàn)操作步驟：

1．蛋白質(zhì)的樣品制備：

1)細(xì)胞培養(yǎng)蛋白質(zhì)樣品的制備：

1：胰酶消化后裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至 80%左右密度時(shí)，以含 0.25%胰蛋白酶消化,室溫，低速離心，棄上清。細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據(jù)細(xì)胞數(shù)量定)反復(fù)吹打。

2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至 80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據(jù)細(xì)胞數(shù)量定)，用細(xì)胞刮刀收集，轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。

2)組織樣品的制備：新鮮組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，按組織凈重：裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理)

3)蛋白變性：處理后的樣品加入樣品緩沖液(按樣品濃度 1：1或1：2的比例)混勻，樣品置 1000C的水浴箱加熱 3-5分鐘，10000g 離心 10分鐘，取上清液。(樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。)

2．SDS-PAGE 電泳：

1)．制膠：①按比例配制分離膠(丙烯酰胺母液：?jiǎn)误w：雙體=29：1)，緩緩地?fù)u動(dòng)溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，37℃恒溫箱中靜置 60min。

②同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時(shí)不要過(guò)于劇烈以免引入過(guò)多的氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，37℃恒溫箱中靜置60min 以上以保證完全聚合。

2)加樣：依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品。(加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應(yīng)。樣品一般在 1.0mm 厚的膠加樣 50-100ug/lane)。

3)電泳：加樣完畢，選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳即可。一般采用恒壓濃縮膠 55V，分離膠 75V，電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。

3．轉(zhuǎn) 膜：蛋白質(zhì)經(jīng) SDS-PAGE 分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纖維膜即 NC 膜(AR0135)或PVDF 膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 結(jié)束后，取出凝膠，在 Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過(guò)程普遍采用電轉(zhuǎn)印法，包括濕式電轉(zhuǎn)印和干式電轉(zhuǎn)印。

1)干式電轉(zhuǎn)?。簩⑥D(zhuǎn)印槽陰極平放工作臺(tái)上，并在上面加三張電轉(zhuǎn)印液浸透的1mm厚的濾紙，將電轉(zhuǎn)印液浸透 0.45μm的N.C 膜放在濾紙上，再將凝膠平放在 N.C 膜上，最后在凝膠上加蓋三層電轉(zhuǎn)印液浸透 1mm 厚的濾紙，電流根據(jù)凝膠面積按 1-2 mA/cm2,接通電源，經(jīng) 1-1.5 小時(shí)電轉(zhuǎn)印。

2)濕式電轉(zhuǎn)?。捍蜷_電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊，再各放三塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與 NC 膜、凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，最后將 NC 膜平放在凝膠上，按照(-)夾板-海棉-濾紙-膠塊-NC 膜-濾紙-海綿-夾板(+)裝好,依次除盡每層間氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。電泳槽加滿預(yù)冷電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)，連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NC 膜應(yīng)對(duì)電泳槽的正極,4℃ 250-300mA,轉(zhuǎn)印 80min(根據(jù)

分子量不同，轉(zhuǎn)印時(shí)間可適當(dāng)調(diào)整)。

4、膜的封閉：漂洗轉(zhuǎn)印膜,室溫，3次 x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS(以免影響抗體的結(jié)合)，放入 0.02M TBS 緩沖液配置的5%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的封閉液內(nèi)，搖床搖動(dòng)，室溫封閉 2h或4℃過(guò)夜。1×TBS-T ，PH7.6洗

液，室溫漂洗10min。

5、抗體雜交：1)封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當(dāng)稀釋的適當(dāng)稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜或37℃孵育2h，1×TBS-T ，PH7.6洗液洗膜 3次 x10min。(一抗的稀釋度，孵育時(shí)間，溫度與顯色強(qiáng)度，背景有直接關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性不強(qiáng)時(shí)可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間，而背景高，非特異性條帶多，則降低抗體濃度和孵育時(shí)間)。

2)用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當(dāng)稀釋過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗大鼠IgG 孵育膜，20℃-37℃,1.5 小時(shí)或4℃過(guò)夜，1×TBS-T洗膜 3×10min。

6、顯色(ECM)

ECM顯色劑配制:按 1ml 蒸餾水，加顯色劑 A、B 各 1 滴混勻。將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液反應(yīng)約 1-5分鐘。吸去印跡膜邊緣顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,以確保×感光膠片的干燥。印跡膜轉(zhuǎn)入暗室中使膠片曝光 30＇-5分鐘。

7、顯影，定影。

ECM Kit(大鼠IgG)細(xì)胞生物學(xué)研究有以下幾個(gè)方面。

細(xì)胞生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細(xì)胞核、染色體以及基因表達(dá)的研究。
②生物膜與細(xì)胞器的研究。
③細(xì)胞骨架體系的研究。
④細(xì)胞增殖及其調(diào)控。
⑤細(xì)胞分化及其調(diào)控。
⑥細(xì)胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細(xì)胞的起源與進(jìn)化。
⑧細(xì)胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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