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蛋白質的電泳分離是重要的生物化學分離純化技術之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下 ,向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。根據(jù)所采用的支持物不同,可分為：瓊脂糖凝膠電泳、淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)最廣泛。它的優(yōu)點為：無電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,可檢出 10-9-10-12mol的樣品,凝膠機械強度大,重復性好以及可以通過調節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠。SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白質的電泳方式,它根據(jù)蛋白分子大小不同，遷移速率的不同而達到分離目的，特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量。

免疫印跡是將凝膠電泳的高分辨力和免疫化學檢測的特異性融為一體。免疫印跡技術首先借助凝膠電泳將蛋白質抗原分離，然后將凝膠中的蛋白質轉印到膜上使之成為被分離的一個拷貝。免疫印跡為檢測樣品中是否存在目的蛋白提供一種可靠的方法，該法鑒定蛋白質的原理是根據(jù)被測蛋白能與特異性抗體結合的特性并通過相對遷移率來體現(xiàn)該蛋白的分子量。如果想要了解樣品中是否存在某一抗原，以及該抗原的含量或該抗原多肽鏈的相對分子質量以及亞型，是否與其他蛋白結合，蛋白質的酪氨酸殘基是否發(fā)生磷酸化等有關問題均可采用免疫印跡。

免疫印跡包括多個簡單步驟，可在一到兩天完成，該方法具有高效，簡便，靈敏等特點。

實驗操作步驟：

1．蛋白質的樣品制備：

1)細胞培養(yǎng)蛋白質樣品的制備：

1：胰酶消化后裂解：細胞培養(yǎng)至 80%左右密度時，以含 0.25%胰蛋白酶消化,室溫，低速離心，棄上清。細胞經預冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據(jù)細胞數(shù)量定)反復吹打。

2：皿上直接裂解：細胞培養(yǎng)至 80%左右密度時，細胞經預冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據(jù)細胞數(shù)量定)，用細胞刮刀收集，轉移至離心管中，反復吹打。

2)組織樣品的制備：新鮮組織塊迅速置于預冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，按組織凈重：裂解液=1：10的比例，加入相應體積的裂解液進行勻漿，離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理)

3)蛋白變性：處理后的樣品加入樣品緩沖液(按樣品濃度 1：1或1：2的比例)混勻，樣品置 1000C的水浴箱加熱 3-5分鐘，10000g 離心 10分鐘，取上清液。(樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃可穩(wěn)定保持數(shù)月。)

2．SDS-PAGE 電泳：

1)．制膠：①按比例配制分離膠(丙烯酰胺母液：單體：雙體=29：1)，緩緩地搖動溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進入凝膠溶液中，37℃恒溫箱中靜置 60min。

②同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多的氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠

溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，37℃恒溫箱中靜置60min 以上以保證完全聚合。

2)加樣：依次加入標準品和待分析樣品。(加樣時間要盡量短，以免樣品擴散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。樣品一般在 1.0mm 厚的膠加樣 50-100ug/lane)。

3)電泳：加樣完畢，選擇適當?shù)碾妷哼M行電泳即可。一般采用恒壓濃縮膠 55V，分離膠 75V，電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。

3．轉膜：蛋白質經 SDS-PAGE 分離后，從凝膠中轉移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纖維膜即 NC 膜(AR0135)或PVDF 膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 結束后，取出凝膠，在 Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。蛋白質從凝膠向膜轉移的過程普遍采用電轉印法，包括濕式電轉印和干式電轉印。

1)干式電轉印：將轉印槽陰極平放工作臺上，并在上面加三張電轉印液浸透的1mm厚的濾紙，將電轉印液浸透 0.45μm的N.C 膜放在濾紙上，再將凝膠平放在 N.C 膜上，最后在凝膠上加蓋三層電轉印液浸透 1mm 厚的濾紙，電流根據(jù)凝膠面積按1-2 mA/cm2,接通電源，經 1-1.5 小時電轉印。

2)濕式電轉印：打開電轉印夾，每側墊上一塊專用的用轉印液浸泡透的海面墊，再各放三塊轉印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與 NC 膜、凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側濾紙上，最后將 NC 膜平放在凝膠上，按照(-)夾板-海棉-濾紙-膠塊-NC 膜-濾紙-海綿-夾板(+)裝好,依次除盡每層間氣泡，夾好電轉印夾。電泳槽加滿預冷電轉印液，插入電轉印夾，將電泳槽放入冰箱內，連接好電極，接通電流，轉印夾的NC 膜應對電泳槽的正極,4℃ 250-300mA,轉印 80min(根據(jù)分子量不同，轉印時間可適當調整)。

4、膜的封閉：漂洗轉印膜,室溫，3次 x10min,以盡量洗去轉印膜上的SDS(以免影響抗體的結合)，放入 0.02M TBS 緩沖液配置的5%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的封閉液內，搖床搖動，室溫封閉 2h或4℃過夜。1×TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗10min。

5、抗體雜交：1)封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當稀釋的一抗，4℃孵育過夜或37℃孵育2h，1×TBS-T ，PH7.6洗液洗膜 3次 x10min。(一抗的稀釋度，孵育時間，溫度與顯色強度，背景有直接關系。一般來說，陽性不強時可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時間，而背景高，非特異性條帶多，則降低抗體濃度和孵育時間)。

2)用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當稀釋過氧化物酶標記兔抗山羊IgG 孵育膜，20℃-37℃,1.5 小時或4℃過夜,1×TBS-T洗膜 3×10min。

6、顯色(ECM)

ECM 顯色劑配制:按 1ml 蒸餾水，加顯色劑 A、B 各 1 滴混勻。將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液反應約 1-5分鐘。吸去印跡膜邊緣顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,以確保×感光膠片的干燥。印跡膜轉入暗室中使膠片曝光 30＇-5分鐘。

7、顯影，定影。將曝光后的×感光膠片放入顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止,再放入定影液中定影，膠片可長期保存。