產(chǎn)品目錄

工作原理：聚合標(biāo)記法是一種酶標(biāo)記方法，其敏感性比普通酶標(biāo)法有明顯提高。用于 Western Blotting的免疫學(xué)檢測，更能體現(xiàn)其優(yōu)點。不僅能大量地節(jié)約一抗，更重要的是使條帶更清晰，甚至能檢測出普通酶標(biāo)法無法檢測出的微量條帶。DAB 是過氧化物酶最重要的顯色劑之一，反應(yīng)產(chǎn)物為不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物，適合于免疫印跡的顯色反應(yīng)。本產(chǎn)品采用特殊配方，具有操作簡單，儲存穩(wěn)定，信號靈敏度高，持續(xù)時間長，背景低，結(jié)果易保存等優(yōu)點。

保存條件：－20℃冷凍保存。DAB 顯色試劑應(yīng)避光保存。

有效期：一年。

試劑盒的內(nèi)容：

(1)封閉試劑：10 g 蛋白干粉×2 包。

(2)濃縮抗體稀釋液：20 ml×1 瓶，為10倍濃縮液。

(3)聚合過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG0.2ml，效價 1：200-400。親和純化抗體，經(jīng)聚合法標(biāo)記過氧化物酶。

(4)DAB顯色試劑，含：

顯色劑 A：DAB×40倍濃縮液，3ml。

顯色劑 B：H2O2×40倍濃縮液，3ml。

顯色劑 C：×40倍 TBS 濃縮緩沖液，3ml。

使用說明：

需要而未提供的試劑和器材：

1．轉(zhuǎn)印了蛋白樣品的NC 膜或PVDF 膜：通過 SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)抗原，將 PAG 膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜(NC 膜)或PVDF 膜上。

2．稀釋緩沖液：使用中性稀釋緩沖液即 0.02 M PBS或0.02M TBS(AR0144)配制封閉液和抗體稀釋液。0.02 M PBS(pH7.2-7.6)：1000 ml 蒸餾水加 Na2HPO4 2.8 g ，NaH2PO4 0.4 g，NaCl 8.5 g。如果用的是含水磷酸鹽，應(yīng)加上分子式中水的含量。0.02M TBS(pH7.2-7.6)：1000ml 蒸餾水中加 Tris 2.42g,NaCl 9g; 純乙酸或濃鹽酸調(diào)節(jié) pH 值(7.2-7.6)。

3．洗滌緩沖液：每 1000ml 中性稀釋緩沖液中加入 0.5 ml Tween20 即可。

4．一抗：選擇適合的一抗，用抗體稀釋液稀釋相應(yīng)的一抗，一般特異性抗體工作濃度為1μg/ml,具體的稀釋度取決于特異性的一抗和膜上的抗原的量。

5．搖床：膜的封閉、抗體孵育和洗滌都需平穩(wěn)搖晃，需在搖床上操作。

6．相機：記錄結(jié)果。

操作程序：

1．通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣本和分子量標(biāo)準(zhǔn)。

2．將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或PVDF 膜上。

3．封閉硝酸纖維膜：用封閉蛋白干粉 2 g,加稀釋緩沖液 100 ml，20-37℃封閉 1-2 小時。用量以浸沒整張膜為準(zhǔn)。

4．用洗滌緩沖液洗滌硝酸纖維素膜 5分鐘,1次。

5．配制抗體稀釋液：取 90 ml 稀釋緩沖液加 1 g 封閉蛋白干粉和 10 ml濃縮抗體稀釋液即可。一抗、二抗均用此稀釋液稀釋。

6．硝酸纖維膜孵育一抗：用抗體稀釋液稀釋相應(yīng)的一抗，一般特異性抗體濃度 1μg/ml,20-37℃孵育2 小時左右。如果缺乏特異性的條帶或陽性不強，應(yīng)提高一抗的濃度；如果有非特異性的條帶，應(yīng)提高一抗的稀釋度。

7．用洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維素膜 3次,每次 5分鐘。

8．硝酸纖維膜孵育二抗：用抗體稀釋液稀釋相應(yīng)的酶標(biāo)二抗，效價 1：200-400。37℃孵育一個半小時左右。用戶可根據(jù)實際染色情況對稀釋度做適當(dāng)調(diào)整。

9．用洗滌緩沖液振蕩洗滌硝酸纖維膜 4次,每次 5分鐘。

10．DAB 顯色:使用 DAB 顯色試劑。按每 2 ml 蒸餾水加顯色劑 A，B，C 各１滴，混勻。混勻后加至膜上。室溫顯色。一般顯色 1－30分鐘。

若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。顯色后用蒸餾水洗滌以終止反應(yīng)。

11．觀察，照相。

注意事項：

Western Blotting DAB顯色法檢測試劑盒(黃色)(山羊IgG)細胞生物學(xué)研究有以下幾個方面。

細胞生物學(xué)的研究內(nèi)容十分廣泛,主要包括。
①細胞核、染色體以及基因表達的研究。
②生物膜與細胞器的研究。
③細胞骨架體系的研究。
④細胞增殖及其調(diào)控。
⑤細胞分化及其調(diào)控。
⑥細胞的衰老與編程性死亡(凋亡)。
⑦細胞的起源與進化。
⑧細胞工程。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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